Bezvīrusu gēnu terapija sniedz cerību hronisku muguras sāpju ārstēšanai

Nesenā pētījumā, kas publicēts žurnālā Biomaterials, pētnieki izstrādāja jaunu nevīrusu gēnu terapiju diskogēnu muguras sāpju (DAS) ārstēšanai, in vivo ievadot transkripcijas faktoru Forkhead Box F1 (FOXF1), izmantojot inženierijas ceļā veidotas ekstracelulāras pūslīšas (eEV), deģeneratīvos starpskriemeļu diskos (IVD).

Hroniskas muguras lejasdaļas sāpes (LBP) ir pieaugoša globāla problēma iedzīvotāju novecošanās un opioīdu problēmu pasliktināšanās dēļ. Pašreizējās ārstēšanas metodes ietver īslaicīgu atvieglojumu vai dārgas operācijas, kas uzsver nepieciešamību pēc atkarību neizraisošām un mazāk invazīvām terapijām.

Pašreizējās bioloģiskās pieejas, tostarp augšanas faktoru ievadīšana, šūnu terapija un vīrusu gēnu terapija, var mazināt deģenerāciju dzīvnieku un cilvēku modeļos. Tomēr tādas problēmas kā īstermiņa iedarbība, slikta ilgtermiņa efektivitāte un nevajadzīga imunogenitāte un onkogenitāte var kavēt šo pieeju tiešu pielietošanu.

Šajā pētījumā pētnieki izveidoja nevīrusu gēnu terapiju starpskriemeļu disku deģenerācijai (IVD), izmantojot FOXF1-eEV.

Pētnieki transfektēja primāros peles embrionālos fibroblastus (PMEF) ar plazmīdām, kas saturēja FOXF1 vai pCMV6 kā kontroli, un raksturoja eEV paraugus, izmantojot nanodaļiņu izsekošanas testu (NTA).

Viņi novērtēja molekulārās kravas efektīvu ielādi eEV, izmantojot kvantitatīvu reversās transkripcijas polimerāzes ķēdes reakciju (qRT-PCR) un parasto PCR. Western blot analīze identificēja FOXF1 un EV specifiskus proteīnus eEV veidojumos. Komanda izmantoja plazmīdas, kas pastiprina augšējos un apakšējos polilinkera reģionus, lai noteiktu FOXF1 plazmīdas DNS klātbūtni donoru šūnās un ģenerētu eEV.

Viņi pārbaudīja pilna garuma mRNS, kas iegūta no plazmīdu DNS eEV un donoru šūnās.

Pētnieki izveidoja ekstracelulāras pūslīšus ar transkripcijas faktoriem, lai atjaunotu audu funkcijas un mainītu sāpju reakcijas DBP dzīvnieku modelī.

Viņi identificēja EV FOXF1 transportēšanai un izplatīšanai bojātos starpskriemeļu diskos diskogēnu muguras sāpju peles modelī, lai noteiktu FOXF1 eEV inhibīciju starpskriemeļu disku deģenerācijā.

Komanda apvienoja peļu starpskriemeļu disku biomehānisko testēšanu ar attēlveidošanu, ārpusšūnu matrices (ECM) izmaiņām un sāpju reakcijām, kas tika novērtētas pēc 12 nedēļām, lai apstiprinātu struktūras un funkcijas izmaiņas, kā arī sāpes, ko izraisījusi terapeitiskā iejaukšanās.

Preoperatīvās un pēcoperācijas sāpju novērtēšana ietvēra mikrodatortomogrāfiju (mikro-DT), magnētiskās rezonanses attēlveidošanu (MRI), mehānisko testēšanu, Alcian zilā (AB) un pikrosīrija sarkanā (PSR) krāsošanu, dimetilmetilēnzilā testu un imūnhistoķīmiju (IHC).

Pētījumā tika izmantota ķirurģiska tehnika, kurā pētnieki subkutāni ievadīja Buprenorfīna ER pelēm, lai kontrolētu pēcoperācijas sāpes.

Komanda veica uzvedības novērtējumus pirms operācijas un ik pēc divām nedēļām no četrām līdz divpadsmit nedēļām pēc operācijas, izmantojot dažādas metodes, tostarp atklātā lauka testu, aukstās plāksnes testu, astes piekares testu un stiepļu piekares testu.

Atklātā lauka testā tika novērtēta peļu spontānā aktivitāte; aukstās plāksnes testos tika mērīta termiskā hiperalgēzija; astes piekares testos tika mērītas aksiālās sāpes; un stiepļu piekares testos tika mērīta izturība.

Divpadsmit nedēļas pēc operācijas komanda, izmantojot augšstilba nervu un artēriju izsekošanu, preparēja dzīvnieku jostas daļas mugurkaulu, lai identificētu starpskriemeļu diskus starp L4 un L5, L5 un L6, kā arī L6 un S1 IVD. Viņi izmantoja L5/L6 IVD, lai novērtētu histoloģiju un noteiktu glikozaminoglikāna (GAG) saturu.

FOXF1 eEV ievērojami samazināja sāpju reakcijas, vienlaikus atjaunojot IVD struktūru un funkciju, tostarp uzlabojot diska augstumu, audu hidratāciju, proteoglikānu saturu un mehāniskās īpašības.

Pētījumā uzmanība tika pievērsta ar FOXF1 ielādētu eEV atbrīvošanai no primārajiem fibroblastiem, kas transfektēti ar transkripcijas faktoru FOXF1. Kvantitatīvā RT PCR uzrādīja ievērojamu FOXF1 mRNS transkripta līmeņa un pilna garuma transkribētās FOXF1 mRNS līmeņa pieaugumu, salīdzinot ar pCMV6 transfektētām šūnām.

FOXF1 eEV terapija var mazināt sāpju reakcijas jostas diska punkcijas modelī pelēm līdz pat 12 nedēļām. Pelu mātītēm FOXF1 ārstēšanas grupā krampju laiks bija ilgāks nekā ievainoto grupā, un tas ilga vismaz 12 nedēļas pēc ārstēšanas.

FOXF1 eEV terapija uzlaboja IVD audu hidratāciju un augstumu ievainotiem un deģeneratīviem dzīvniekiem in vivo, vienlaikus saglabājot hidratācijas līmeni un IVD diska T2 svērto attēla intensitāti.

Tomēr komanda novēroja diska augstuma samazināšanos ievainotiem dzīvniekiem un dzīvniekiem, kas tika ārstēti ar pCMV6 eEV. Pelēm, kas tika ārstētas ar FOXF1 eEV, 12 nedēļas pēc ārstēšanas diska augstums nesamazinājās. Dzimums neietekmēja funkcionālos rezultātus.

FOXF1 eEV atjaunoja bojātu un deģenerētu IVD mehānisko funkciju in vivo. Aksiālā sprieguma apstākļos ar FOXF1 eEV apstrādātie IVD uzrādīja augstāku normalizēto NZ stingrību salīdzinājumā ar bojātiem IVD.

Šļūdes apstākļos bojātiem IVD bija palielinātas normalizētās šļūdes nobīdes, kas norāda uz normalizētās šļūdes elastības stingrības samazināšanos.

Rezultāti liecina, ka GAG satura samazināšana bojātos IVD palielina mehānisko elastību, bet eEV terapija novērš glikozaminoglikānu zudumu un sekojošas mehāniskās funkcijas izmaiņas.

FOXF1 eEV izraisīja strukturālas un funkcionālas izmaiņas IVD, palielinot proteoglikāna un GAG līmeni.

Pētījuma rezultāti parādīja, ka ar attīstības transkripcijas faktoriem piesātinātas eEV var ārstēt sāpīgas locītavu slimības, piemēram, DBP, ar IVD palīdzību nogādājot šos transkripcijas faktorus deģeneratīvās un sāpīgās locītavās.

Šī stratēģija var palīdzēt mazināt slimības izraisītās strukturālās un funkcionālās anomālijas un regulēt sāpju reakcijas dzimumspecifiskā veidā.

Pētnieki ieteica arī izmantot attīstības transkripcijas faktorus, piemēram, FOXF1, lai in vivo deģeneratīvas NP šūnas pārietu proanaboliskā stāvoklī. Lai noteiktu tā terapeitisko efektivitāti, ir nepieciešami turpmāki pētījumi.