Tuberkulozes laboratoriskā diagnostika

Tuberkuloze ir slimība, ko mūsdienu apstākļos un zinātnes sasniegumos ir viegli diagnosticēt. Tuberkulozes laboratoriskā diagnostika ieņem centrālo vietu starp citām diagnostikas metodēm, otrajā vietā aiz rentgena izmeklēšanas metodēm.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Klīniskā asins analīze

Pacientiem ar tuberkulozi vispārējā asins analīzē izmaiņas nav patognomoniskas. Ierobežotās un zemas aktivitātes tuberkulozes formās raksturīga eritrocītu hipohromija ar normālu skaitu. Masīvu infiltrātu vai kazeozas pneimonijas gadījumā, ar plaši izplatītu kazeozu limfadenītu, specifiskiem zarnu bojājumiem, kā arī ar lieliem plaušu vai pēcoperācijas asiņojumiem, tiek novērota eritropēnija un mikrocitoze, oligohromāzija, polihromāzija. Makrocitoze, un īpaši poikilocitoze, ir sastopama daudz retāk, parasti ar smagu anēmiju. Retikulocītu skaits kompensētā tuberkulozes stadijā svārstās no 0,1 līdz 0,6%, subkompensētā stadijā - no 0,6 līdz 1,0%, bet dekompensētā stadijā raksturīgi 1% retikulocītu.

Dažos tuberkulozes gadījumos var novērot mērenu leikocitozi (līdz 15 tūkstošiem leikocītu), retāk leikopēniju, kas rodas 2–7% gadījumu pacientiem ar ierobežotām un vieglām procesa formām un 12,5% gadījumu destruktīvas un progresējošas plaušu tuberkulozes gadījumā.

Visbiežāk nobīdes rodas leikocītu formulā. Tiek atzīmēta gan relatīvā, gan absolūtā neitrofīlija, mērena leikocītu formulas nobīde pa kreisi promielocītu virzienā. Mielocīti ļoti reti sastopami nekomplicētas tuberkulozes gadījumos. Neitrofilu skaita palielināšanās ar patoloģisku granularitāti tuberkulozes pacienta hemogramā vienmēr norāda uz procesa ilgumu: pacientiem ar smagu tuberkulozes formu gandrīz visiem neitrofiliem ir patoloģiska granularitāte. Kad tuberkulozes uzliesmojums norimst, kodola nobīde relatīvi ātri atgriežas normālā stāvoklī. Neitrofilu patoloģiskā granularitāte parasti saglabājas ilgāk nekā citas izmaiņas hemogramā.

Eozinofilu saturs perifērajās asinīs svārstās arī atkarībā no procesa fāzes un organisma alerģiskā stāvokļa. To skaits samazinās līdz aneozinofīlijai smagos un ilgstošos slimības uzliesmojumos un, gluži pretēji, palielinās infiltrātu rezorbcijas un pleiras izsvīduma laikā, kā arī primārās tuberkulozes agrīnās formās.

Lielāko daļu primārās tuberkulozes formu pavada limfopēnija, kas dažreiz novērojama vairākus gadus pat pēc specifisku izmaiņu rētošanās. Sekundārā tuberkuloze akūtā fāzē, atkarībā no procesa smaguma pakāpes, var noritēt vai nu ar normālu limfocītu skaitu, vai limfopēniju.

Starp tuberkulozes procesa novērtēšanas testiem īpašu vietu ieņem eritrocītu sedimentācijas ātruma (ESR) noteikšana, kas ir svarīgs tuberkulozes procesa gaitas novērtēšanā un tā aktīvo formu identificēšanā. ESR palielināšanās norāda uz patoloģiska procesa klātbūtni (infekciozi iekaisīgs, strutains, septisks, hemoblastoze, limfogranulomatoze utt.) un kalpo kā tā smaguma rādītājs, taču normālas ESR vērtības ne vienmēr norāda uz patoloģijas neesamību. Eritrocītu sedimentācijas paātrināšanos veicina globulīnu, fibrinogēna, holesterīna satura palielināšanās asinīs un asins viskozitātes samazināšanās. Eritrocītu sedimentācijas palēnināšanās ir raksturīga stāvokļiem, ko pavada hemokoncentrācija, albumīnu un žultsskābju satura palielināšanās.

Tuberkulozes pacientu hemogramma ārstēšanas laikā mainās. Jo veiksmīgāka ir terapeitiskā iejaukšanās, jo ātrāk izzūd hematoloģiskās izmaiņas. Vienlaikus jāpatur prātā dažādu antibakteriālu zāļu ietekme uz hematopoēzi. Tās bieži izraisa eozinofiliju, dažos gadījumos - leikocitozi un biežāk leikopēniju līdz pat agranulocitozei un limfoīdo-retikulārai reakcijai. Sistemātiska hematoloģiskā uzraudzība un iegūto datu pareiza analīze ir būtiska, lai novērtētu pacienta klīnisko stāvokli, procesa dinamiku un ārstēšanas efektivitāti.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ]

Klīniskā urīna analīze

Urīnceļu tuberkulozes gadījumā galvenā laboratoriskā diagnostikas metode ir urīna analīze. Var novērot leikocitūriju, eritrocitūriju, proteinūriju, hipoizostenūriju, tuberkulozo mikobakteriūriju, nespecifisku bakteriūriju.

Leikocitūrija ir visizplatītākais urīnceļu tuberkulozes simptoms pirms specifiskas ķīmijterapijas, un tā nav novērojama tikai izņēmuma gadījumos, piemēram, pilnīgas urīnvada lūmena izzušanas gadījumā. Nečiporenko tests (leikocītu skaita noteikšana 1 ml urīna) palīdz objektīvāk novērtēt leikocitūrijas pakāpi nefrotuberkulozes gadījumā un dažos gadījumos to atklāt ar normālu vispārēju urīna analīzi. Tomēr jāņem vērā, ka leikocitūrija var rasties akūta un hroniska pielonefrīta, cistīta, uretrīta, nierakmeņu un urīnvadu gadījumā.

Eritrocitūrija, tāpat kā leikocitūrija, tiek uzskatīta par vienu no visbiežāk sastopamajām uroģenitālās tuberkulozes laboratoriskajām pazīmēm. Hematūrijas biežums ir atkarīgs no procesa izplatības; tas palielinās, attīstoties destruktīvajam tuberkulozes procesam nierēs. Eritrocitūrija bez leikocitūrijas ir raksturīgāka nieru tuberkulozes agrīnajām stadijām. Hematūrija, kas dominē pār leikocitūriju, ir svarīgs arguments par labu nieru tuberkulozei, to diferencējot no nespecifiska pielonefrīta.

[ 10 ], [ 11 ], [ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ]

Bioķīmiskā asins analīze

Tuberkulozes gadījumā dažu bioķīmisko rādītāju izmaiņas galvenokārt ir atkarīgas no procesa fāzes, komplikācijām un dažādām vienlaicīgām slimībām. Pacientiem ar neaktīvu plaušu un citu orgānu tuberkulozi kopējais olbaltumvielu daudzums un olbaltumvielu frakcijas asins serumā nemainās un nosaka to normālo saturu.

Akūtās slimības formās, kā arī hronisku tuberkulozes formu saasināšanās un progresēšanas gadījumā albumīna-globulīna koeficients samazinās.

Būtiska nozīme aknu funkcionālā stāvokļa un organisko bojājumu novērtēšanā tuberkulozes un tās komplikāciju gadījumā ir tiešā un kopējā bilirubīna, aspartātaminotransferāzes (AST) un alanīnaminotransferāzes (ALT) noteikšanai asins serumā. Aminotransferāžu līmeņa dinamiska noteikšana. Bilirubīna līmenis tuberkulozes pacientu ārstēšanā, īpaši tās smagajās formās, ir obligāta tuberkulozes pacientu bioķīmiskās izmeklēšanas sastāvdaļa un tiek veikta katru mēnesi.

Nieru funkcionālā stāvokļa novērtēšana ietver seruma kreatinīna līmeņa noteikšanu un glomerulārās filtrācijas ātruma aprēķināšanu, izmantojot Kokrofta-Golta formulu. Glomerulārās filtrācijas ātruma aprēķināšana, izmantojot Reberga testu, sniedz mazāk precīzus rezultātus.

Tuberkulozes pacientu dinamisko bioķīmisko pētījumu galvenais mērķis ir uzraudzīt procesa gaitu, savlaicīgi atklāt zāļu blakusparādības un atbilstoši koriģēt radušos homeostāzes traucējumus.

[ 17 ], [ 18 ], [ 19 ]

Bioķīmisko pētījumu metožu pielietošana ekstrapulmonālā tuberkulozē

Visinformatīvākais rādītājs tiek uzskatīts par tuberkulostearīnskābes saturu bioloģiskajos šķidrumos, tomēr tā noteikšana ir saistīta ar tehniskām grūtībām (nepieciešamība izmantot gāzu hromatogrāfiju un masas spektrometriju).

Daudzsološi ir izmērīt adenozīna deamināzes aktivitāti - enzīmu, ko nosaka šķidrumos: sinoviālajā, perikarda, ascīta vai cerebrospinālajā šķidrumā. Galvenie adenozīna deamināzes ražotāji ir limfocīti un monocīti. Adenozīna deamināzes aktivitātes noteikšana bioloģiskajos šķidrumos atvieglo tuberkulozā sinovīta, limfmezglu tuberkulozes, tuberkulozā meningīta un tuberkulozā serozīta diagnostiku.

Daži bioķīmiskie indikatori to nespecifiskā rakstura dēļ tiek noteikti tikai bioloģiskajos šķidrumos bojājuma tuvumā. Indikatoru līmenis tiek mērīts, reaģējot uz tuberkulīna subkutānu vai intradermālu ievadīšanu (parasti pirms ievadīšanas un 48 un 72 stundas pēc tās). Pēc tam tiek aprēķināta marķiera līmeņa paaugstināšanās pakāpe (%) attiecībā pret sākotnējo līmeni.

Optimāli orgānu specifiskā enzīma transamidināzes aktivitāti nosaka urīnā; tā parādīšanās ir novērojama dažādas izcelsmes nieru bojājumu gadījumā. Transamidināzes izpēte ir pamatota tikai tuberkulīna subkutānas ievadīšanas apstākļos, lai saasinātu lokālo iekaisuma procesu. Transamidināzes aktivitāti urīnā nosaka sākotnēji un 24–72 stundas pēc 50 TE tuberkulīna ievadīšanas. Fermentūrijas palielināšanās 2 vai vairāk reizes ļauj 82% gadījumu atšķirt aktīvu nieru tuberkulozi no hroniska pielonefrīta saasināšanās.

Sieviešu dzimumorgānu tuberkulozes gadījumā haptoglobīna un malondialdehīda koncentrāciju asinīs nosaka provokatīvā tuberkulīna testa apstākļos. Tuberkulīnu ievada subkutāni 50 TE devā, un pēc 72 stundām veic atkārtotu bioķīmisko izmeklējumu. Tuberkulozes etioloģijas gadījumā haptoglobīna līmeņa paaugstināšanās pakāpe ir vismaz 28%, bet malondialdehīda līmenis ir 39% vai vairāk. Tiek izmantota arī adenozīna deamināzes aktivitātes noteikšana peritoneālajā šķidrumā, kas iegūts no Duglasa maisiņa. Punkciju atkārtoti pārbauda 72 stundas pēc tuberkulīna intradermālas ievadīšanas 0,1 TE un 0,01 TE devās iekšējo dzimumorgānu projekcijas zonā uz vēdera priekšējās sienas. Adenozīna deamināzes aktivitātes palielināšanās par 10% vai vairāk, salīdzinot ar sākotnējo vērtību, norāda uz tuberkulozu procesu.

Acu bojājumu gadījumā tiek pārbaudīta fokālā reakcija, kas rodas acī, reaģējot uz antigēna stimulāciju. Šajā gadījumā nav vēlama asi izteiktas reakcijas attīstība, ko pavada redzes funkciju samazināšanās. Tā kā minimālu fokālo reakciju novērtēšana bieži vien ir sarežģīta, ieteicams paralēli koncentrēties uz haptoglobīna vai adenozīna deamināzes līmeņa paaugstināšanās pakāpi asins serumā, lai objektīvi noteiktu secinājumu.

Visi bioķīmiskie pētījumi jāveic kombinācijā ar citām metodēm.

[ 20 ], [ 21 ], [ 22 ], [ 23 ]

Asins koagulācijas sistēmas izpēte

Asins koagulācijas sistēmas stāvokļa izpētes nozīme ftizioloģijā ir saistīta ar hemoptīzes jeb plaušu asiņošanas klātbūtni vairākiem pacientiem ar plaušu tuberkulozi, kā arī hemokoagulācijas komplikācijām tuberkulozes ķirurģiskā ārstēšanā. Turklāt dabiski pavadošā latentā intravaskulārā hemokoagulācija ietekmē slimības gaitu un ķīmijterapijas efektivitāti.

Pacientiem ar plaušu tuberkulozi, kuriem ir dominējoša eksudatīvā iekaisuma komponente, novērojama asins antikoagulanta aktivitātes samazināšanās. Pacientiem ar zemu specifisku plaušu bojājumu izplatību, kuriem ir dominējoša produktīvā iekaisuma komponente, intravaskulāra hemokoagulācija ir nenozīmīga. Pacientiem ar plaušu tuberkulozi ar hemoptīzi un plaušu asiņošanu asins koagulācijas sistēmas stāvoklis ir atšķirīgs: pacientiem ar nelielu asins zudumu hemoptoēzes kulminācijā vai tūlīt pēc tās pārtraukšanas novērojama strauja asins koagulācijas spējas palielināšanās, pateicoties izteiktai trombīna veidošanās procesu intensifikācijai, vienlaikus saglabājot paaugstinātu "strukturālo" koagulējamību. Pacientiem ar masīvu asins zudumu novērojama koagulācijas potenciāla samazināšanās, jo samazinās fibrinogēna koncentrācija, XIII faktora aktivitāte un trombocītu skaits. Ķirurģiskas ārstēšanas stadijā pacientiem ar ierobežotām plaušu tuberkulozes formām homeostāzes sistēmā būtiski traucējumi nerodas. Pacientiem ar plaši izplatītiem procesiem, veicot pneimonektomiju vai pleiropneimonektomiju, bieži attīstās DIC sindroms, kas var izpausties kā "otrā slimība".

Lai uzraudzītu asins koagulācijas sistēmas stāvokli pacientiem ar plaušu tuberkulozi, jānosaka aktivētais daļējais tromboplastīna laiks (APTT), fibrinogēns, trombīna laiks, protrombīna indekss, kā arī asiņošanas laiks un asins recēšanas laiks.

[ 24 ], [ 25 ], [ 26 ], [ 27 ], [ 28 ]

Hormonālie pētījumi

Mūsdienu eksperimentālie un klīniskie novērojumi liecina par hormonālā stāvokļa izmaiņām specifiska plaušu tuberkulozes iekaisuma gadījumā. Ir pierādīts, ka hipofīzes-virsnieru, hipofīzes-vairogdziedzera sistēmu un aizkuņģa dziedzera darbības traucējumu korekcija kombinācijā ar prettuberkulozes terapiju veicina fibroģenēzes un reparācijas procesu aktivizēšanos specifiskā iekaisuma perēklī.

Hipofīzes-vairogdziedzera sistēmas funkcionālo stāvokli vērtē pēc trijodtironīna (T3), tiroksīna (T4) un hipofīzes vairogdziedzeri stimulējošā hormona (TSH) satura asins serumā _. Ir _konstatēts, ka subklīniska hipotireoze tiek atklāta 38–45 % pacientu ar plaušu tuberkulozi, un to visbiežāk diagnosticē izkliedētās un fibrozi kavernozās procesa formās. Šajās formās visstraujāk samazinās gan T3, gan T4 līmenis _, un šo hormonu _{nelīdzsvarotība izpaužas kā T4/} T3 _attiecības palielināšanās.

Virsnieru garozas funkciju novērtē pēc kortizola līmeņa serumā, bet aizkuņģa dziedzera endokrīno funkciju - pēc imunoreaktīvā insulīna koncentrācijas. Infekcijas slimības akūtā fāzē palielinās nepieciešamība pēc endogēnā kortizola un insulīna. Hiperinsulinēmija norāda arī uz ķermeņa audu rezistenci pret insulīnu, kas ir raksturīga jebkuram aktīvam iekaisuma procesam, īpaši specifiskam. Virsnieru glikokortikoīdu funkcijas noteikšana aktīvas plaušu tuberkulozes gadījumā ļauj noteikt hiperkorticisma klātbūtni lielākajai daļai pacientu. Normāla kortizola koncentrācija asinīs pacientam ar infekciozu iekaisumu akūtā periodā jāuzskata par virsnieru garozas glikokortikoīdu funkcijas relatīvu nepietiekamību, kas var kalpot par pamatu aizstājterapijai ar atbilstošām glikokortikoīdu devām.

Gandrīz trešdaļai pacientu ar plaušu tuberkulozi ir zems insulīnēmijas līmenis, kas tuvojas normas apakšējai robežai, savukārt 13–20 % pacientu ir ievērojams hiperinsulinisms. Gan relatīvs hipo-, gan hiperinsulinisms ir augsta riska faktori dažādas smaguma pakāpes ogļhidrātu metabolisma traucējumu attīstībai. Šīs aizkuņģa dziedzera B šūnu funkcionālās aktivitātes izmaiņas prasa regulāru glikēmijas kontroli pacientiem ar tuberkulozi un savlaicīgu cukura diabēta profilaksi. Turklāt tas kalpo kā papildu pamatojums fizioloģisku insulīna devu lietošanas piemērotībai tuberkulozes kompleksajā terapijā.

Kopumā vairogdziedzera hormonu līmeņa samazināšanās, to nelīdzsvarotība, hiperkortizolēmija un hiperinsulinisms ir visizteiktākie pacientiem ar smagu tuberkulozes procesa gaitu, ar plašiem plaušu bojājumiem un izteiktiem tuberkulozes intoksikācijas simptomiem.

Tuberkulozes mikrobioloģiskā diagnostika

Mikrobioloģiskie pētījumi ir nepieciešami, lai identificētu pacientus ar tuberkulozi, pārbaudītu diagnozi, uzraudzītu un koriģētu ķīmijterapiju, novērtētu ārstēšanas rezultātus, citiem vārdiem sakot, no brīža, kad pacients ar tuberkulozi tiek reģistrēts, līdz brīdim, kad viņš tiek izslēgts no reģistra.

Visas epidemioloģiskās programmas un projekti ir balstīti uz baktēriju izvadītāju skaita novērtējumu, ko nav iespējams izdarīt, neizmantojot laboratorijas metodes tuberkulozes mikobaktēriju noteikšanai. Izskatot tā sauktās neorganizētās populācijas pievilcību, baktēriju izvadītāju procentuālais daudzums sasniedz 70 vai vairāk, kas padara laboratorijas metodes par diezgan efektīvu līdzekli tuberkulozes pacientu identificēšanai šajā iedzīvotāju grupā.

Tradicionālās mikrobioloģiskās tuberkulozes diagnostikas metodes ir bakterioskopiskie un kultūras pētījumi. Mūsdienu metodes ietver tuberkulozes mikobaktēriju kultivēšanu automatizētās sistēmās un PCR. Tomēr visas šīs metodes obligāti tiek apvienotas ar klasiskajām bakterioloģiskajām metodēm.

Diagnostiskā materiāla savākšana

Laboratorisko izmeklējumu efektivitāte lielā mērā ir atkarīga no diagnostikas materiāla kvalitātes. Diagnostikas materiāla savākšanas, uzglabāšanas un transportēšanas noteikumu ievērošana un pacienta izmeklēšanas algoritma precīza ieviešana tieši ietekmē rezultātu un nodrošina bioloģisko drošību.

Tuberkulozes testēšanai izmanto dažādus materiālus. Tā kā plaušu tuberkuloze ir visizplatītākā tuberkulozes infekcijas forma, par galveno testējamo materiālu tiek uzskatītas krēpas un cita veida traheobronhiālā koka izdalījumi: augšējo elpceļu izdalījumi, kas iegūti pēc aerosolu inhalācijām: bronhu skalošanas ūdeņi; bronhoalveolārie skalojumi; materiāls, kas iegūts bronhoskopijas, transtraheālas un intrapulmonālas biopsijas laikā: bronhu aspirāts, balsenes uztriepes, eksudāti, brūču uztriepes utt.

Pētījuma efektivitāte palielinās, ja tiek veikta kontrolēta materiāla savākšana no pacienta. Šim nolūkam tiek piešķirta speciāli aprīkota telpa vai iegādātas speciālas kabīnes. Materiāla savākšana ir bīstama procedūra, tāpēc pētījuma materiāls jāsavāc, ievērojot infekcijas drošības noteikumus.

Materiāls Mycobacterium tuberculosis testēšanai tiek savākts sterilās pudelītēs ar cieši aizskrūvējamiem vāciņiem, lai novērstu vides piesārņošanu un pasargātu savākto materiālu no piesārņojuma.

Diagnostiskā materiāla savākšanas flakoniem jāatbilst šādām prasībām:

• jābūt izgatavotam no triecienizturīga materiāla;
• autoklāvā viegli jāizkūst;
• jābūt pietiekama tilpuma (40–50 ml):
• ir plaša atvere krēpu savākšanai (diametrs nav mazāks par 30 mm);
• jābūt viegli apstrādājamam, caurspīdīgam vai caurspīdīgam, lai savāktā parauga daudzumu un kvalitāti varētu novērtēt, neatverot vāku.

Lai iegūtu optimālus pētījuma rezultātus, jāievēro šādi nosacījumi:

• materiāla savākšana jāveic pirms ķīmijterapijas sākuma;
• pētījuma materiāls jāsavāc pirms ēšanas vai zāļu lietošanas no rīta;
• Pētījumam ieteicams savākt vismaz 3 rīta krēpu paraugus. Krēpas tiek savāktas 3 dienas pēc kārtas;
• Savāktais materiāls pēc iespējas ātrāk jānogādā laboratorijā:
• gadījumos, kad materiālu nav iespējams nekavējoties nogādāt laboratorijā, to uzglabā ledusskapī 4 °C gaisa temperatūrā ne ilgāk kā 48 stundas;
• Transportējot materiālu, ir jāpievērš īpaša uzmanība pudeļu integritātei.

Pareizi savāktām krēpām ir gļotainības vai gļotainas-strutojoša rakstura pazīmes. Optimālais pārbaudītās krēpu daļas tilpums ir 3-5 ml.

Krēpas tiek savāktas veselības aprūpes darbinieka uzraudzībā. Personām, kas ir atbildīgas par krēpu savākšanu, jānodrošina noteiktu noteikumu ievērošana:

• Pacientam ir jāpaskaidro izmeklēšanas mērķis un nepieciešamība atklepot nevis siekalas vai nazofaringālas gļotas, bet gan dziļo elpceļu daļu saturu. To var panākt produktīva klepus rezultātā, kas rodas pēc vairākām (2-3) dziļām ieelpām. Tāpat ir jābrīdina pacients, ka vispirms viņam jāizskalo mute ar vārītu ūdeni, lai noņemtu galveno mutes dobumā veģetējošās mikrofloras daļu un pārtikas atliekas, kas sarežģī krēpu izmeklēšanu;
• Medicīnas darbiniekam, kas iesaistīts krēpu savākšanā, papildus halātam un cepurei jāvalkā maska, gumijas cimdi un gumijas priekšauts;
• Stāvot aiz pacienta, viņam ieteicams turēt pudeli pēc iespējas tuvāk lūpām un nekavējoties atdalīt krēpas tajā, kad viņš tās klepo, vienlaikus nodrošinot, ka gaisa plūsma ir vērsta prom no veselības aprūpes darbinieka:
• Kad krēpu savākšana ir pabeigta, veselības aprūpes darbiniekam rūpīgi jāaizver pudele ar vāku un jānovērtē savākto krēpu daudzums un kvalitāte. Pēc tam pudele tiek marķēta un ievietota speciālā kastē transportēšanai uz laboratoriju.

Ja pacientam neizdalās krēpas, tad iepriekšējā vakarā un agri no rīta materiāla savākšanas dienā viņam jāievada atkrēpošanas līdzeklis: altejas sakņu ekstrakts (mukaltīns), bromheksīns, ambroksols u. c. — vai arī jāveic kairinoša inhalācija, izmantojot telpā uzstādīto krēpu savākšanas aprīkojumu. Šādi savāktais materiāls nav paredzēts konservēšanai un tas jāpārbauda savākšanas dienā. Lai izvairītos no tā "noraidīšanas" laboratorijā, nosūtījumā jāizdara īpaša atzīme.

Ja konkrētajā iestādē mikrobioloģiskie pētījumi netiek veikti, savāktais diagnostikas materiāls jānogādā laboratorijā centralizēti, ar nosacījumu, ka materiāls starp piegādēm tiek uzglabāts ledusskapī vai kopā ar konservantiem. Materiāls uz laboratoriju tiek piegādāts transporta kastēs, kuras var viegli dezinficēt. Katram paraugam jābūt aprīkotam ar atbilstošu etiķeti, un visai partijai jābūt aizpildītai pavadveidlapai.

[ 29 ], [ 30 ], [ 31 ]

Pacientu izmeklēšanas veidi un biežums

Sākotnējās, tā sauktās, diagnostiskās, pacienta tuberkulozes izmeklēšanas laikā ir jāpārbauda vismaz 3 krēpu porcijas, kas savāktas medicīnas personāla uzraudzībā 2 vai 3 dienu laikā, kas palielina mikroskopijas efektivitāti.

Primārā tuberkulozes skrīnings jāveic visām veselības aprūpes sistēmas medicīnas un diagnostikas iestādēm. Nesen, lai palielinātu primārās pārbaudes efektivitāti, uz klīniski diagnostisko laboratoriju bāzes ir organizēti tā sauktie mikroskopijas centri, kas aprīkoti ar moderniem mikroskopiem un aprīkojumu epidēmijas drošības nodrošināšanai.

Prettuberkulozes iestādes izmanto apsekošanas shēmu, kas paredz vismaz 3 reizes veikt krēpu vai cita diagnostikas materiāla izmeklēšanu 3 dienu laikā. Ārstēšanas laikā intensīvās ķīmijterapijas fāzē mikrobioloģiskie pētījumi tiek veikti regulāri vismaz reizi mēnesī. Pārejot uz novērošanas fāzi, pētījumi tiek veikti retāk - ar 2-3 mēnešu intervālu, savukārt pētījumu biežums tiek samazināts līdz diviem.

Diagnostiskā materiāla savākšanas iezīmes ekstrapulmonālai tuberkulozei

Patoloģiskā materiāla iezīme ekstrapulmonālās tuberkulozes formās ir zema mikobaktēriju tuberkulozes koncentrācija tajā, kas prasa jutīgākas mikrobioloģiskās izpētes metodes, galvenokārt sēšanas metodes uz barības vielu barotnes.

Urogenitālās tuberkulozes gadījumā urīns ir vispieejamākais materiāls izmeklēšanai. Urīna savākšana jāveic speciāli apmācītai medmāsai.

Ārējos dzimumorgānus mazgā ar ūdeni un ziepēm vai vāju kālija permanganāta šķīdumu. Urīnizvadkanāla ārējo atveri rūpīgi apstrādā. Rīta urīna vidējo daļu savāc sterilā pudelē: vīriešiem - dabiski, sievietēm - izmantojot katetru. Urīnu no nieru iegurņa savāc sterilās mēģenēs vienas vai divu nieru kateterizācijas laikā, pēdējā gadījumā - obligāti atsevišķi no katras nieres. Nelielu daudzumu šī urīna centrifugē, nogulsnes pārbauda.

Vīriešiem spermatozoīdus, sēklinieku punkcijas un prostatas sekrētus centrifugē, lai iegūtu nogulsnes. Ar jebkādu specifiska procesa lokalizāciju dzimumorgānu apvidū vīriešiem prostatas masāža var veicināt tuberkulozes mikobaktērijas saturošu sekrētu izdalīšanos.

Menstruālās asinis no sievietēm savāc ar atsūknēšanas metodi vai izmantojot Kafkas uzgali. Iegūto materiālu atbrīvo no eritrocītiem, mazgājot to ar destilētu ūdeni un pēc tam centrifugējot. Nogulsnes tiek pārbaudītas.

Izdalījumi no dzemdes kakla kanāla tiek savākti kādā traukā vai Kafkas vāciņā, tas ir, ir vēlams uzkrāt 1-2 ml patoloģiskā materiāla.

Materiāls, kas iegūts ķirurģisku iejaukšanos laikā nierēs, dzimumorgānos, biopsijās, endometrija nokasījumos, tiek homogenizēts. Šim nolūkam to ievieto sterilā piestā un rūpīgi sasmalcina ar sterilām šķērēm. Iegūtajai suspensijai pievieno sterilas upes smiltis daudzumā, kas vienāds ar tās masu, pēc tam pievieno 0,5–1,0 ml izotoniska nātrija hlorīda šķīduma un visu samaļ, līdz izveidojas putraina masa, pievienojot izotonisku nātrija hlorīda šķīdumu (4–5 ml). Pēc tam masai ļauj nosēsties 1–1,5 minūtes, pārbauda virsējo slāni.

Kaulu un locītavu tuberkuloze. Ar sterilu šļirci iegūto dūriena paraugu (strutas no abscesiem) ievieto sterilā traukā un nekavējoties nogādā laboratorijā. Izmantojot sterilu pipeti, kas iepriekš samitrināta ar sterilu izotonisku nātrija hlorīda šķīdumu, paņem 2–5 ml strutu, pārnes pudelē ar lodītēm un pievieno vēl 2–3 ml izotoniska nātrija hlorīda šķīduma. Pudeli aizver ar aizbāzni un krata kratītājā 8–10 minūtes. Homogenizēto suspensiju pārbauda.

Osteoartikulāras tuberkulozes fistulu formu gadījumā no fistulas tiek paņemtas strutas. Bagātīgas strutas tiek savāktas tieši mēģenē. Nelielas strutu izdalīšanās gadījumā fistulas traktu mazgā ar sterilu izotonisku nātrija hlorīda šķīdumu, un skalošanas šķidrumus, kas savākti mēģenē vai strutās samērcētā tampona gabaliņā, nosūta izmeklēšanai.

Ķirurģisks materiāls, kas iegūts ķirurģisku iejaukšanos laikā kaulos un locītavās, var sastāvēt no strutainām nekrotiskajām masām, granulācijām, rētaudiem, kaulu audiem, sinoviālā membrānas audiem un citiem substrātiem. Tā apstrāde tiek veikta tāpat kā nieru tuberkulozes gadījumā.

Tūlīt pēc punkcijas tiek veikta sinoviālā šķidruma mikrobioloģiskā izmeklēšana 3% nātrija citrāta šķīdumā (attiecībā 1:1), lai novērstu recēšanu.

Limfmezglu tuberkuloze. Limfmezglu punkcijas laikā iegūtās strutas tiek pārbaudītas tāpat kā abscesu strutas. Limfmezglu audi, kas iegūti ķirurģisku iejaukšanos un biopsiju laikā, tiek pārbaudīti tāpat kā citu tuberkulozes formu gadījumā.

Mycobacterium tuberculosis fekāliju izpēte tiek veikta ārkārtīgi reti, jo gandrīz pilnībā nav pozitīvu rezultātu.

[ 32 ], [ 33 ], [ 34 ], [ 35 ], [ 36 ]

Mikobaktēriju mikroskopija

Krēpu mikroskopija ir relatīvi ātra, vienkārša un lēta metode, kas jāizmanto visos gadījumos, kad ir aizdomas par tuberkulozi. Turklāt šis pētījums tiek veikts, lai novērtētu ķīmijterapijas efektivitāti un apstiprinātu atveseļošanos vai ārstēšanas neveiksmi, ja nav kultūras rezultātu.

Mikroskopiskai izmeklēšanai tiek izmantotas divas metodes:

• tiešās mikroskopijas metode, kad uztriepe tiek sagatavota tieši no diagnostikas materiāla;
• nogulumu mikroskopijas metode, kas sagatavota no materiāla, kas apstrādāts ar dekontaminācijas līdzekļiem kultūras pētījumiem.

Pirmā metode tiek izmantota tajās laboratorijās, kurās tiek veikti tikai mikroskopiski pētījumi (vispārējā medicīnas tīkla klīniskās diagnostikas laboratorijas).

Vislabākos mikroskopiskās izmeklēšanas rezultātus iegūst, koncentrējot diagnostisko materiālu (piemēram, centrifugējot).

Lai ar mikroskopijas palīdzību ar 50% varbūtību atklātu Mycobacterium tuberculosis, 1 ml krēpu jāsatur vairāk nekā 5000 mikrobu šūnu. Pacientu ar plaušu tuberkulozes formām krēpās parasti ir ievērojams skaits skābi izturīgu baktēriju, kas ļauj tās droši noteikt ar bakterioskopiju. Šīs metodes diagnostisko jutību var palielināt, pārbaudot vairākus viena pacienta krēpu paraugus. Negatīvs bakterioskopiskās izmeklēšanas rezultāts neizslēdz tuberkulozes diagnozi, jo dažu pacientu krēpās ir mazāk Mycobacterium, nekā var noteikt ar mikroskopijas palīdzību. Negatīva bakterioskopiskās izmeklēšanas rezultāta cēlonis var būt arī slikta krēpu uztriepes sagatavošana.

Visizplatītākā metode skābes izturīgu mikobaktēriju noteikšanai uztriepē ir Cīla-Nīlzena krāsošana. Metodes pamatā ir karbolfuksīna iekļūšana mikrobu šūnā caur membrānu, kas ietver vaska-lipīdu slāni, vienlaikus iedarbojoties karsēšanai un fenola spēcīgajai kodināšanas iedarbībai. Turpmāka uztriepes atkrāsošana ar 25% sērskābes vai 3% sālsskābes spirta šķīdumu noved pie visu skābes neizturīgo struktūru atkrāsošanās. Uztriepes atkrāsotie elementi tiek iekrāsoti ar 0,3% metilēnzilā šķīdumu. Mikobaktērijas neuztver parastās anilīna krāsvielas, kā rezultātā skābes izturīgās mikobaktērijas iekrāsojas aveņsarkanā krāsā, bet citi mikrobi un šūnu elementi - zilā krāsā.

Lai pārbaudītu uztriepes, kas iekrāsotas saskaņā ar Cīla-Nīlzena metodi, izmanto gaismas binokulāro mikroskopu ar iegremdēšanas objektīvu (90 vai 100 reižu palielinājums) un okulāru ar 7 vai 10 reižu palielinājumu. Tiek pārbaudīti 100 redzes lauki, kas ir pietiekami, lai uztriepē noteiktu atsevišķas mikobaktērijas. Ja šādas pārbaudes rezultāts ir negatīvs, apstiprināšanai ieteicams pārbaudīt vēl 200 redzes laukus. Rezultāti tiek reģistrēti, norādot noteikto skābes izturīgo mikobaktēriju (AFB) skaitu.

Papildus šai metodei luminiscējošajā mikroskopijā tiek izmantota fluorohroma krāsošana, kas ļauj sasniegt vislabākos rezultātus. Šīs metodes izmantošana palielina mikroskopijas efektivitāti par 10–15 %. Apstrādājot mikobaktērijas ar luminiscējošām krāsvielām (auramīnu, rodamīnu utt.), šīs vielas saistās arī ar mikrobu šūnas vaskveida struktūrām. Apstarojot iekrāsotās šūnas ar ierosinošu gaismas avotu (noteiktu ultravioletā starojuma spektru), tās sāk mirdzēt oranžā vai spilgti sarkanā krāsā uz melna vai tumši zaļa fona. Redzamā attēla augstā spilgtuma un kontrasta dēļ mikroskopa kopējo palielinājumu var samazināt 4–10 reizes, kas paplašina redzes lauku un samazina preparāta skatīšanās laiku. Līdz ar to, pateicoties ievērojami lielākam lauka dziļumam, var palielināt pētījuma komfortu.

Izmantojot fluorescences mikroskopiju, viena un tā paša uztriepes laukuma apskate aizņem ievērojami mazāk laika nekā uztriepes, kas iekrāsotas pēc Cīla-Nīlzena metodes, gaismas mikroskopija. Ja mikroskopists darba dienas laikā apskata aptuveni 20–25 šādas uztriepes, tad ar fluorescences mikroskopijas palīdzību viņš tajā pašā laikā var pārbaudīt vairāk nekā 60–80 paraugus. Pieredzējuši mikroskopisti zina, ka šūnu krāsošana ar auramīna un rodamīna maisījumu kaut kādā veidā ir specifiska skābi izturīgām mikobaktērijām, kurām šajā gadījumā ir zeltainu stieņu izskats. Saprofīti iekrāsojas zaļganā krāsā.

Vēl viena svarīga fluorescences mikroskopijas metodes priekšrocība ir spēja noteikt izmainītas mikobaktērijas, kas vairāku nelabvēlīgu faktoru, jo īpaši intensīvas ķīmijterapijas, ietekmē ir zaudējušas savas skābes rezistences īpašības, un tāpēc tās nevar noteikt ar Ziehl-Nelsen krāsošanu.

Fluorescences mikroskopijas metodes trūkumi ietver mikroskopa un tā ekspluatācijas relatīvi augstās izmaksas. Tomēr centralizētās vai citās lielās laboratorijās, kur darba slodze pārsniedz trīs laboratorijas tehniķu darba normu ar trim parastajiem mikroskopiem, lētāk ir izmantot vienu fluorescences mikroskopu.

Bakterioskopiskajām metodēm ir diezgan augsta specifiskums (89–100%). Aptuveni 97% pozitīvu rezultātu, kas iegūti ar jebkuru mikroskopijas metodi, ir skaidri apstiprināti ar sēšanas rezultātiem.

Jāatzīmē, ka patoloģiskā materiāla uztriepes mikroskopiskā izmeklēšana neļauj noteikt konstatēto skābes rezistento mikobaktēriju sugu. Mikroskopiskā metode ļauj izdarīt secinājumu tikai par skābes rezistentu mikroorganismu klātbūtni vai neesamību preparātā, kas izskaidrojams ar lielu skaitu netuberkulozu skābes rezistentu mikroorganismu, kas morfoloģiski ir līdzīgi tuberkulozes kompleksa mikobaktērijām.

Mikroskopijas rezultātu novērtēšana tiek veikta puskvantitatīvās vienībās.

Lai varētu salīdzināt dažādu mikroskopijas metožu rezultātus, tiek ieviesti empīriski koeficienti. Piemēram, lai salīdzinātu ar fluorescējošām krāsvielām iekrāsotas uztriepes rezultātus ar gaismas mikroskopijas pētījuma (1000 reižu palielinājums) datiem, ir nepieciešams dalīt ar fluorescējošo mikroskopu noteikto skābi izturīgo mikobaktēriju skaitu ar atbilstošo koeficientu: pie mikroskopa 250 reižu palielinājuma - ar 10, pie 450 reižu palielinājuma - ar 4, pie 630 reižu palielinājuma - ar 2.

Mikroskopijas iezīmes ekstrapulmonālā tuberkulozē

Tiek veikta tiešā mikroskopija, kā arī pēc bagātināšanas sagatavoto uztriepju mikroskopija ar sekojošu krāsošanu pēc Cīla-Nīlzena metodes vai fluorescējošām krāsvielām. Uztriepju tiešā mikroskopija ir neefektīva, jo materiālā ir zema mikobaktēriju koncentrācija, tāpēc racionālāk ir izmantot bagātināšanas metodes. Visefektīvākā ir centrifugēšana. Ja bioloģiskais materiāls ir viskozs, tiek izmantota centrifugēšana ar vienlaicīgu materiāla homogenizāciju un sašķidrināšanu, ko veic, izmantojot ātrgaitas centrifūgas ar centrifugēšanas spēku 3000 g un hipohlorīta šķīdumus. Citas bagātināšanas metodes, piemēram, mikroflotācija, pašlaik netiek izmantotas bioloģiski bīstamu aerosolu veidošanās dēļ.

[ 37 ]

Kultūras metode tuberkulozes diagnosticēšanai

Sēšanas metode jeb kultivēšanas metode ir jutīgāka nekā uztriepes mikroskopija un tai ir vairākas priekšrocības salīdzinājumā ar pēdējo. Tā ļauj noteikt vairākus desmitus dzīvotspējīgu mikobaktēriju izmeklējamajā materiālā un tai ir augsta diagnostiskā vērtība. Tas ir īpaši svarīgi, pārbaudot materiālu no nesen diagnosticētiem vai ārstētiem pacientiem, kuriem izdalās neliels daudzums mikobaktēriju.

Salīdzinot ar mikroskopiju, kultūras pētījumi ļauj palielināt atklāto tuberkulozes pacientu skaitu par vairāk nekā 15–25 %, kā arī pārbaudīt tuberkulozi agrīnākās stadijās, kad slimība vēl ir viegli ārstējama. Par ļoti svarīgu kultūras pētījumu priekšrocību tiek uzskatīta iespēja iegūt patogēna kultūru, ko var identificēt un pētīt saistībā ar zāļu jutību, virulenci un citām bioloģiskām īpašībām.

Kultivēšanas metožu trūkumi ietver to ilgumu (materiālu gaidīšanas periods sasniedz 10 nedēļas), augstākas izmaksas un diagnostiskā materiāla apstrādes sarežģītību.

Diagnostiskā materiāla pirmssējas apstrādes principi

Tradicionālās mikrobioloģiskās metodes tuberkulozes testu veikšanai nevar izmantot. Tas ir saistīts ar faktu, ka tuberkulozes mikobaktērijas aug ļoti lēni, un lielākā daļa klīnisko paraugu satur ātri augošus strutainus un pūšanas mikroorganismus un sēnītes. To straujā augšana uz bagātīgām barības vielām traucē mikobaktēriju attīstību un neļauj izolēt tuberkulozes patogēnu, tāpēc diagnostiskais materiāls pirms sēšanas ir jāapstrādā. Turklāt no pacienta elpceļiem izdalītās mikobaktērijas parasti ieskauj liels daudzums gļotu, kas apgrūtina to koncentrēšanu. Šajā sakarā pirms krēpu un citu līdzīgu materiālu sēšanas tie ir jāsašķidrina un jāattīra.

Visiem mazgāšanas līdzekļiem un dekontaminatoriem ir vairāk vai mazāk izteikta toksiska ietekme uz mikobaktērijām. Apstrādes rezultātā var iet bojā līdz pat 90% mikobaktēriju. Lai saglabātu pietiekamu mikobaktēriju populācijas daļu, nepieciešams izmantot saudzīgas apstrādes metodes, kas, no vienas puses, ļauj nomākt ātri augošos strutainos un pūšanas procesus veicinošos mikroorganismus, un, no otras puses, maksimāli saglabāt materiālā esošo mikobaktēriju dzīvotspēju.

Atkarībā no materiāla, tā homogenitātes un piesārņojuma līmeņa pirms iesēšanas apstrādei izmanto dažādus dekontaminācijas līdzekļus: krēpām - 4% nātrija hidroksīda šķīdumu, 10% trinātrija fosfāta šķīdumus, benzalkonija hlorīda trinātrija fosfātu, NALC-NaOH (N-acetil-L-cisteīna-nātrija hidroksīdu) ar galīgo NaOH koncentrāciju 1%, urīnam un citiem šķidriem materiāliem - 3% sērskābes šķīdumu, piesārņotiem paraugiem, taukus saturošiem materiāliem - skābeņskābes šķīdumu līdz 5%. Turklāt dažos gadījumos tiek izmantoti enzīmi un virsmaktīvās vielas (mazgāšanas līdzekļi). Tween un dažu citu mazgāšanas līdzekļu lietošana ir saistīta ar mazāku mikobaktēriju šūnu bojāeju (izdzīvo 40-50%). Tomēr tos var izmantot tikai šķidriem materiāliem. NALC-NaOH, kas ražots komplektos, ir visplašāk izmantotais pasaulē. Šī metode ļauj izolēt vairāk nekā 85% mikobaktēriju šūnu populācijas. Audu saturošu cietvielu dekontaminācija ir sarežģītāka, jo ir grūti uzminēt materiāla dispersijas pakāpi homogenizācijas laikā. Piemēram, limfmezglu biopsiju apstrāde bieži vien ir saistīta ar palielinātu piesārņojuma biežumu ar svešu floru. Šajā gadījumā var izmantot 1% etoniju.

Nehomogēns materiāls tiek homogenizēts, izmantojot stikla lodītes dekontaminantu klātbūtnē. Šķidrie materiāli tiek iepriekš centrifugēti, un tiek apstrādāti tikai nogulumi.

Sēšanas un inkubācijas tehnika

Pēc sākotnējās apstrādes materiāls tiek centrifugēts, kas nogulsnē mikobaktērijas un palielina to saturu nogulsnēs ("nogulšņu bagātināšana"). Iegūtās nogulsnes neitralizē un inokulē uz blīvu barības vielu vai mēģenu virsmas ar šķidru (pusšķidru) barotni. No atlikušajām nogulsnēm sagatavo uztriepes mikroskopiskai izmeklēšanai. Sēšanas tehnikai jānovērš diagnostikas materiāla savstarpēja piesārņošana.

Lai nodrošinātu ticamu mikrobioloģiskā pētījuma rezultātu klīnisko interpretāciju, jāievēro šāds noteikums: mikroskopiskie un kultūras pētījumi jāveic paralēli no viena un tā paša diagnostikas materiāla parauga.

Inokulētās mēģenes 2 dienas ievieto termostatā 37 ^° C temperatūrā horizontālā stāvoklī. Tas nodrošina vienmērīgāku materiāla iesūkšanos barības vielu vidē. Pēc 2 dienām mēģenes pārvieto vertikālā stāvoklī un hermētiski noslēdz ar gumijas vai silikona aizbāžņiem, lai novērstu iesētās vides izžūšanu.

Kultūraugi tiek turēti termostatā 37 ^° C temperatūrā 10–12 nedēļas, veicot regulāras iknedēļas pārbaudes. Katrā kontroles pārbaudē tiek reģistrēti šādi parametri:

• vizuāli novērojamas augšanas periods no sējas dienas;
• augšanas ātrums (CFU skaits);
• kultūras piesārņojums ar svešu mikrobu floru vai sēnītēm (šādas mēģenes tiek izņemtas);
• nav redzama apauguma. Caurules tiek atstātas termostatā līdz nākamajai pārbaudei.

Barības vielas

Mikobaktēriju kultivēšanai tiek izmantotas dažādas barotnes: cietas, pusšķidras, šķidras. Tomēr nevienai no zināmajām barotnēm nepiemīt īpašības, kas nodrošinātu visu mikobaktēriju šūnu augšanu. Šajā sakarā, lai uzlabotu efektivitāti, ieteicams vienlaikus izmantot 2–3 dažāda sastāva barotnes.

Kā standarta barotni tuberkulozes izraisītāja primārajai izolēšanai un tā jutības pret zālēm noteikšanai PVO iesaka Lovenšteina-Jensena barotni. Tā ir blīva olu barotne, uz kuras mikobaktēriju augšana tiek iegūta 20.–25. dienā pēc bakterioskopiski pozitīva materiāla iesēšanas. Bakterioskopiski negatīva materiāla sēšanai nepieciešams ilgāks inkubācijas periods (līdz 10–12 nedēļām).

Mūsu valstī plaši izplatījusies ER Finn piedāvātā Finn-II olu barotne. Tā atšķiras ar to, ka L-asparagīna vietā tajā tiek izmantots nātrija glutamāts, kas mikobaktērijās iedarbina citus aminoskābju sintēzes ceļus. Augšana šajā barotnē parādās nedaudz agrāk, un mikobaktēriju izolēšanas biežums ir par 6–8 % lielāks nekā Lovenšteina-Jensena barotnē.

Lai palielinātu ekstrapulmonālās tuberkulozes bakterioloģiskās diagnostikas efektivitāti, barības vielu kompleksā ieteicams iekļaut modificētas Finn-II barotnes. Lai paātrinātu augšanu, Finn-II barības vielu vidē papildus ievada 0,05% nātrija tioglikolātu, kas samazina skābekļa koncentrāciju. Lai aizsargātu mikobaktēriju enzīmu sistēmas no lipīdu peroksidācijas toksiskajiem produktiem, Finn-II barības vielu vidē ievada antioksidantu α-tokoferola acetātu 0,001 μg/ml koncentrācijā. Diagnostikas materiālu sēj, izmantojot standarta metodi.

Krievijas prettuberkulozes laboratorijās tiek izmantotas arī citas blīvu barības vielu modifikācijas: GG Mordovska ierosinātā barības vielu barotne "Novaja", V. Anikina izstrādātās barības vielu barotnes A-6 un A-9 u.c.

Tā kā ķīmijterapijas laikā rodas bojājumi dažādām mikrobu šūnas vielmaiņas sistēmām, daļa mikobaktēriju populācijas zaudē spēju normāli attīstīties uz parastajām barības vielām un tai ir nepieciešamas osmotiski līdzsvarotas (pusšķidras vai šķidras) barības vielas.

Diagnostiskā materiāla kultūras rezultātu novērtēšana un reģistrēšana

Daži mikobaktēriju celmi un veidi aug lēni, augšana var parādīties pat 90. dienā. Šādu kultūru skaits ir neliels, taču tas liek sējumus turēt termostatā 2,5–3 mēnešus.

Virulentās Mycobacterium tuberculosis kultūras parasti aug uz cietas olu barotnes kā dažāda izmēra un izskata R formas kolonijas. Kolonijas ir sausas, grumbainas, ziloņkaula krāsā un nedaudz pigmentētas. Uz citām barotnēm Mycobacterium tuberculosis kolonijas var būt mitrākas. Pēc ķīmijterapijas kursa vai ārstēšanas laikā var izolēt gludas kolonijas ar mitru augšanu (S formas).

Izolējot kultūras, tiek izmantots īpašu pētījumu kopums, lai atšķirtu tuberkulozes mikobaktērijas no ne-tuberkulozes mikobaktērijām un skābēm izturīgām saprofītām.

Pozitīva atbilde tiek sniegta pēc obligātas mikroskopiskas izmeklēšanas, kas veikta ar izaugušo koloniju uztriepi, kas iekrāsota saskaņā ar Ziehl-Nelsen metodi. Mikobaktēriju augšanas gadījumā uztriepēs atrodami spilgti sarkani stieņi, kas atrodas atsevišķi vai grupās, veidojot kopas filca vai bizīšu formā. Jaunās kultūrās, īpaši tajās, kas izolētas no pacientiem, kuri ilgstoši ārstēti ar ķīmijterapiju, mikobaktērijas izceļas ar izteiktu polimorfismu, līdz pat īsu, gandrīz kokoīdu vai iegarenu variantu klātbūtnei, kas atgādina sēnīšu micēliju, kā arī stieņveida formām.

Mikobaktēriju augšanas intensitāti nosaka pēc šādas shēmas: (+) - 1-20 CFU mēģenē (zema baktēriju izdalīšanās); (++) - 20-100 CFU mēģenē (mērena baktēriju izdalīšanās); (+++) - >100 CFU mēģenē (bagāta baktēriju izdalīšanās). Tuberkulozes laboratoriskajā diagnostikā nepietiek tikai ar atbildi, kas norāda, vai ar konkrētu metodi ir atklātas mikobaktērijas. Ir nepieciešams arī detalizēts priekšstats par mikobaktēriju populācijas apjomu un raksturu, tās sastāvu un īpašībām. Tieši šie dati ļauj pareizi interpretēt procesa stāvokli, plānot taktiku un savlaicīgi pielāgot ārstēšanu.

Pēdējos gados ir ierosinātas uz agara bāzes veidotas barības barotnes ar dažādām augšanas piedevām un īpaša gāzu maisījuma izmantošana, lai paātrinātu mikobaktēriju augšanu. Lai panāktu mikobaktēriju augšanu uz šīm barotnēm, kultivēšanas laikā tiek radīta atmosfēra ar paaugstinātu oglekļa dioksīda saturu (4–7%). Šim nolūkam tiek izmantoti speciāli CO2 inkubatori _. Tomēr vislielāko attīstību ir guvušas automatizētas mikobaktēriju kultivēšanas sistēmas: MGIT-BACTEC-960 un MB/Bact.

Viena no šādām sistēmām ir MGIT (mikobaktēriju augšanas indikācijas mēģenes) sistēma, kas ir augsto tehnoloģiju izstrādājums un paredzēta paātrinātai tuberkulozes bakterioloģiskajai diagnostikai un mikobaktēriju jutības noteikšanai pret pirmās izvēles zālēm un dažām otrās izvēles zālēm. MGIT ir paredzēta lietošanai kā daļa no VASTEC-960 ierīces. Mikroorganismus kultivē īpašās mēģenēs ar šķidru barības vielu barotni, kuras pamatā ir modificēta Middlebrook-7H9 barotne. Lai stimulētu mikobaktēriju augšanu un nomāktu svešas mikrofloras augšanu, tiek izmantots MGIT augšanas papildinājums un PANTA antibakteriālo zāļu maisījums.

Mikroorganismu augšana tiek reģistrēta optiski. Tā balstās uz fluorescenci, kas rodas, kad mikobaktērijas augšanas laikā patērē skābekli. Speciālas mēģenes apakšā atrodas no skābekļa atkarīga fluorohroma krāsviela, kas pārklāta ar silikona slāni. Mikobaktēriju vairošanās noved pie skābekļa daudzuma samazināšanās mēģenē un tā koncentrācijas samazināšanās, kas izraisa fluorescences palielināšanos, kas kļūst redzama, kad mēģeni apstaro ar ultravioleto gaismu, un ko automātiski reģistrē fotosensori, kas iebūvēti VASTES-960 ierīcē. Luminiscences intensitāte tiek reģistrēta augšanas vienībās (GU). Augšanas dati tiek automātiski ievadīti datorā, kur tos var saglabāt. Augšanas līkņu datoranalīze var sniegt informāciju par dažādu mikobaktēriju kopu, tostarp ne-tuberkulozo, klātbūtni, kā arī palīdz novērtēt mikobaktēriju augšanas īpašības.

Šādu sistēmu ieviešanas rezultātā mikobaktēriju augšanas laiks ir ievērojami samazinājies, vidēji 11 dienas uz VASTEC-960 un 19 dienas uz MB/Bact, salīdzinot ar 33 dienām uz standarta blīvas barības vielu barotnes. Jāatzīmē, ka šīm sistēmām ir nepieciešams augsti kvalificēts personāls. Materiāla sēšana uz šķidrām barotnēm obligāti notiek kopā ar sēšanu uz Lovenšteina-Jensena barotnes, kas kalpo kā rezerves barotne gadījumos, kad tuberkulozes mikobaktērijas neaug uz citām barotnēm.

[ 38 ], [ 39 ], [ 40 ], [ 41 ], [ 42 ], [ 43 ]

Mikobaktēriju jutības pret zālēm noteikšana

Mikobaktēriju spektra un jutības pakāpes noteikšana pret prettuberkulozes līdzekļiem ir ļoti klīniska, kā arī zāļu rezistentas tuberkulozes izplatības epidemioloģiskai novērtēšanai. Turklāt zāļu rezistences uzraudzība ļauj novērtēt prettuberkulozes programmas efektivitāti kopumā, būdama neatņemams rādītājs visu prettuberkulozes pasākumu komponentu darbam.

Zāļu jutības testēšanas biežums un laiks:

• pirms ārstēšanas uzsākšanas, vienreiz, lai noteiktu ārstēšanas stratēģiju un taktiku:
• Izolējot kultūras no dažādiem pacienta materiāliem (krēpas, BAL, urīns, eksudāti, cerebrospinālais šķidrums utt.), tiek pārbaudīti visi izolētie celmi:
• intensīvās ārstēšanas fāzes beigās, ja nav klīniskās un radioloģiskās dinamikas:
• ja nepieciešams mainīt ārstēšanas shēmu šādos gadījumos:
  • krēpu negativitātes trūkums;
  • atkārtota kultivēšana pēc krēpu negativitātes;
  • straujš AFB daudzuma pieaugums uztriepē pēc sākotnēja samazinājuma. Ir labi zināms, ka no tuberkulozes pacienta materiāla tiek izolēti Mycobacterium tuberculosis celmi ar atšķirīgu jutību pret zālēm. Celmu jutība pret prettuberkulozes līdzekļiem var atšķirties pēc zāļu spektra, pakāpes, biežuma un rezistences attīstības ātruma.

Mycobacterium tuberculosis zāļu rezistences pakāpi nosaka saskaņā ar noteiktajiem kritērijiem, kas ir vērsti uz rezistences klīnisko nozīmi un ir atkarīgi no zāļu prettuberkulozes aktivitātes, to farmakokinētikas, koncentrācijas bojājumā, maksimālās terapeitiskās devas utt.

Mikobaktēriju jutības pret zālēm noteikšana pašlaik tiek veikta, izmantojot mikrobioloģiskās metodes:

• absolūtās koncentrācijas (atšķaidīšanas metode uz cietas vai šķidras barības vielu barotnes),
• proporcijas,
• pretestības koeficients.

Parasti rezistence izpaužas kā vizuāli novērojama mikobaktēriju tuberkulozes koloniju augšana, tomēr ir metodes, kas izraisa augšanu mikobaktēriju šūnu dalīšanās sākumposmā krāsu reakciju veidā. Šīs metodes samazina testa laiku no 3-4 līdz 2 nedēļām.

PVO Ķīmijterapijas komitejas ieteiktā absolūtās koncentrācijas metode Krievijā ir plaši izplatījusies kā vienota metode. No metodoloģiskā viedokļa tā ir vienkāršākā, taču tai nepieciešama augsta standartizācija un laboratorijas procedūru precizitāte. Zāļu jutības tests sastāv no mēģenīšu komplekta ar barības vielu barotni, kas modificēta ar prettuberkulozes līdzekļiem. Komplektā ietilpst 2-3 mēģenes ar dažādu katras no izmantotajām zālēm koncentrāciju, viena kontroles mēģene ar barotni bez zālēm un viena mēģene, kas satur 1000 μg/ml nātrija salicilāta vai 500 μg/ml paranitrobenzoskābes, lai noteiktu ne-tuberkulozes mikobaktēriju augšanu.

Lai sagatavotu barotnes komplektu ar preparātiem, izmanto modificētu Lovenšteina-Jensena barotni (bez cietes), ko ielej kolbās. Katrā kolbā pievieno noteiktu tilpumu atbilstošā prettuberkulozes zāļu atšķaidījuma. Kolbu saturu rūpīgi samaisa, ielej mēģenēs un koagulē slīpā stāvoklī 40 minūtes 85 °C temperatūrā. Barotni ieteicams koagulēt elektriskā koagulatorā ar automātisku temperatūras kontroli. Barotne ar prettuberkulozes zālēm

1. rindas zāles var uzglabāt ledusskapī 2–4 °C temperatūrā 1 mēnesi, ar 2. rindas zālēm – ne ilgāk kā 2 nedēļas. Medikamentu uzglabāšana istabas temperatūrā nav pieļaujama. Sagatavojot prettuberkulozes zāļu šķīdumus, tiek ņemta vērā to aktivitāte, aprēķinot koncentrāciju, koriģējot zāļu nespecifiskās daļas molekulmasu, tīrību utt. Lai noteiktu zāļu jutību, tiek izmantotas tikai ķīmiski tīras vielas.

Metodes princips ir noteikt prettuberkulozes zāļu koncentrāciju, kas nomāc ievērojamas mikobaktēriju populācijas daļas augšanu. Pareizi izpildīta, šai metodei ir laba ticamība.

Pirms testa veikšanas jāpārliecinās, ka izolētā Mycobacterium tuberculosis kultūra nesatur svešas mikrofloras piemaisījumus. No mikobaktēriju kultūras 0,9% nātrija hlorīda šķīdumā sagatavo homogēnu suspensiju, kas satur 500 miljonus mikrobu ķermeņu 1 ml tilpumā (optiskās duļķainības standarts 5 vienības). Iegūto suspensiju atšķaida ar 0,9% nātrija hlorīda šķīdumu (1:10) un katrā barotnes komplekta mēģenē pievieno 0,2 ml suspensijas. Inokulētās mēģenes ievieto termostatā 37 °C temperatūrā un tur horizontāli 2–3 dienas, lai barotnes slīpā virsma būtu vienmērīgi inokulēta ar Mycobacterium tuberculosis suspensiju. Pēc tam mēģenes pārvieto vertikālā stāvoklī un inkubē 3–4 nedēļas. Rezultātus reģistrē pēc 3–4 nedēļām.

Tā kā patogēna izolēšana no klīniskā materiāla barības vielu vidē aizņem vismaz 1–1,5 mēnešus, zāļu jutības noteikšanas rezultātus, izmantojot šo metodi, var iegūt ne agrāk kā 2–2,5 mēnešus pēc materiāla iesēšanas. Šis ir viens no galvenajiem metodes trūkumiem.

Mikobaktēriju zāļu jutības testu rezultāti tiek interpretēti, pamatojoties uz noteiktiem kritērijiem. Cietās barotnēs kultūra tiek uzskatīta par jutīgu pret barotnē esošo zāļu koncentrāciju, ja noteiktā mēģenē ar zālēm audzēto mikobaktēriju koloniju skaits nepārsniedz 20, bet kontroles mēģenē bez zālēm ir vērojama bagātīga augšana. Kultūra tiek uzskatīta par rezistentu pret noteiktu koncentrāciju tikai tad, ja koloniju skaits pārsniedz 20. Praksē, ja augšanas rezultāti mēģenēs ir tuvu 20 CFU, ir jāpaziņo klīniskajai nodaļai, ka jutība vai rezistence šajā gadījumā ir robežstāvoklī, jo tas dažkārt var izskaidrot klīnisko rādītāju neskaidro dinamiku.

Dažādiem preparātiem tiek noteikta noteikta koncentrācija, pie kuras tiek novērota mikobaktēriju populācijas kritiskās daļas vairošanās. Šīs koncentrācijas sauc par "kritiskajām". Kā stabilitātes kritērijs tiek izmantots mikobaktēriju populācijas augšanas apjoms barības vielu vidē ar preparātu kritiskā koncentrācijā.

Vietējā ftizioloģijas praksē, nosakot zāļu rezistenci, neaprobežojas tikai ar kritisko koncentrāciju noteikšanu. Tas ir saistīts ar faktu, ka paplašināta patogēna zāļu rezistences līmeņa definīcija ļauj klīnicistam pareizāk formulēt ķīmijterapijas taktiku, izmantojot zināšanas par zāļu kombināciju pastiprinošo iedarbību, paredzēt krustenisko rezistenci vai lietot efektīvākas zāles no izmantotās prettuberkulozes zāļu grupas.

Absolūtās koncentrācijas metode ir vienkāršākā, bet arī visjutīgākā pret kļūdām, kas pieļautas tās ieviešanas laikā. Uzticamāka, īpaši nosakot jutību pret otrās izvēles medikamentiem, un plaši izplatīta ārpus Krievijas ir proporciju metode. Tā ņem vērā absolūtās koncentrācijas metodes trūkumus, taču tās ieviešana ir darbietilpīgāka.

Metode ir ļoti līdzīga absolūtās koncentrācijas metodei. Mēģenu sagatavošana ar zālēm ir tāda pati kā absolūtās koncentrācijas metodē. Tomēr tuberkulozes mikobaktēriju suspensijas sēklas deva tiek samazināta 10 reizes, kas novērš dažu tuberkulozes mikobaktēriju celmu spontānas rezistences biežumu pret tādām zālēm kā etambutols, protionamīds, kapreomicīns. Kā kontroles mēģenes ar sēklas devu, kas vienāda ar mēģenēs esošo devu, secīgi atšķaidītas 10 un 100 reizes. Rezistences kritērijs ir vizuāli novērotās tuberkulozes mikobaktēriju augšanas proporcija. Pirmās līnijas zālēm rezistences kritērijs ir pārmērīga augšana par 1% no sākotnējās populācijas, otrās līnijas zālēm - augšana par 1 vai vairāk nekā 10% no sākotnējās populācijas atkarībā no izvēlētās kritiskās koncentrācijas.

1997. gadā PVO un Starptautiskās savienības pret tuberkulozi darba grupa par tuberkulozes zāļu rezistences noteikšanu veica korekcijas šajos kritērijos, ierosinot uzskatīt par rezistentām mikobaktērijas, kas aug blīvā Lovenšteina-Jensena olu barotnē šādās koncentrācijās:

• dihidrostreptomicīns - 4 μg/ml;
• izoniazīds — 0,2 µg/ml:
• rifampicīns - 40 mkg/ml:
• Etambutols - 2 mkg/ml.

2001. gadā tika ierosinātas kritiskās koncentrācijas šādiem otrās izvēles medikamentiem (kritiskajai daļai 1%):

• kapreomicīns - 40 mkg/ml;
• protionamīds - 40 mkg/ml;
• kanamicīns — 30 μg/ml;
• viomicīns - 30 μg/ml;
• cikloserīns - 40 mkg/ml;
• aminosalicilskābe - 0,5 mkg/ml;
• ofloksacīns - 2 mkg/ml.

Augšanas rezultāti tiek novērtēti pēc 4 nedēļām kā provizoriski un pēc 6 audzēšanas nedēļām kā galīgie.

Lai noteiktu zāļu jutību pret pirazinamīdu, ko plaši izmanto mūsdienu tuberkulozes ķīmijterapijā, ieteicamā kritiskā koncentrācija ir 200 μg/ml. Tomēr joprojām nav vispārpieņemtas metodes zāļu rezistences noteikšanai pret šīm zālēm uz cietām barības vielu barotnēm, jo to antibakteriālā aktivitāte izpaužas tikai skābā vidē (pH <6), ko ir tehniski grūti uzturēt. Turklāt daudzas Mycobacterium tuberculosis klīniskās kultūras nelabprāt aug olu barotnēs ar skābu vidi.

Lai novērtētu mikobaktēriju zāļu jutības noteikšanas rezultātu kvalitāti, ieteicams kontrolēt katru jaunu Lovenšteina-Jensena barotnes partiju, paralēli nosakot standarta muzeja celma H37Rv jutību. Turklāt ir jāievēro noteikti mikrobioloģiskie kritēriji, lai metodes sniegtu labi reproducējamu un pareizi interpretējamu rezultātu. Tie ietver tuberkulozes mikobaktēriju kultūras dzīvotspēju, noteikumus homogēnas suspensijas un suspensijas iegūšanai, noteikumus tuberkulozes mikobaktēriju kultūru atlasei un atlasītās baktēriju masas reprezentativitāti. Zāļu rezistences noteikšanas ticamība samazinās, ja baktēriju izdalīšanās ir ārkārtīgi slikta.

Nesen par daudzsološu ir atzīta metode zāļu jutības noteikšanai, izmantojot automatizētas sistēmas. Vismodernākās šajā jomā ir izstrādes, kuru pamatā ir VASTEC MGIT-960. Šajā gadījumā tuberkulozes mikobaktēriju zāļu jutība tiek noteikta, pamatojoties uz modificētu proporciju metodi. Noteikšanas laikā tiek salīdzināts tuberkulozes mikobaktēriju augšanas ātrums kontroles mēģenē un mēģenēs ar zālēm. Lai noteiktu jutību pret streptomicīnu, izoniazīdu, rifampicīnu un etambutolu, tiek izmantotas bagātinošas piedevas un antibiotikas, kas iekļautas SIRE komplektā. Lai noteiktu jutību pret pirazinamīdu, tiek izmantots PZA komplekts. Testa laikā mēģenes ar zālēm tiek inokulētas ar tuberkulozes mikobaktēriju suspensiju, kā arī kontroles mēģenes ar 100 reižu atšķaidītu suspensiju visām zālēm, izņemot pirazinamīdu, kur suspensijas atšķaidījums ir 10 reižu. Stabilitātes kritērijs ir mikobaktēriju augšanas rādītājs 100 GU, kad augšana kontroles mēģenē sasniedz 400 GU (sk. "Kultūras metodes mikobaktēriju izolēšanai"). Rezultāti tiek reģistrēti un interpretēti automātiski, un tos iestata ievadītā vai izvēlētā programma.

Kā kritiskās koncentrācijas tiek izmantotas galīgās koncentrācijas mēģenē ar šķidru barības vielu barotni. Pašlaik kritiskās koncentrācijas ir izstrādātas gan pirmās izvēles zālēm, gan dažām otrās izvēles zālēm. Jāatzīmē, ka tuberkulozes mikobaktēriju jutības noteikšana pret cikloserīnu un aminosalicilskābi tiek veikta tikai olu barības vielu barotnēs.

Detalizēts protokols darbam ar aprakstīto sistēmu ļauj veikt zāļu jutības testus gan izolētā kultūrā (ar blīvu barības vielu barotni), gan izmantojot mikobaktēriju primāro augšanu MGIT mēģenē. Pēdējā iespēja ievērojami samazina kultūras pētījumu veikšanai nepieciešamo laiku, ļaujot pilnīgus tuberkulozes mikobaktēriju kultūras rezultātus (ieskaitot informāciju par zāļu jutību) iegūt 3 nedēļu laikā pēc materiāla savākšanas, savukārt tradicionālā metode to var nodrošināt tikai 3. mēnesī. Savlaicīgi rezultāti, kad pacients atrodas intensīvās ārstēšanas fāzē, var kompensēt pētījumu relatīvi augstās izmaksas.

[ 44 ], [ 45 ], [ 46 ], [ 47 ], [ 48 ], [ 49 ], [ 50 ]

Mikobaktēriju diferenciācija

Ņemot vērā, ka izmantotās barotnes nav stingri selektīvas, sekojoša izolēto mikobaktēriju diferenciācija tiek uzskatīta par obligātu. Mikobaktēriju diferenciācijas nepieciešamība ir saistīta ar vairākām ģints pārstāvju izraisīto patoloģisko procesu iezīmēm: tuberkulozes un mikobakteriozes atšķirīgā gaita un iznākums, dabiskas zāļu rezistences klātbūtne pret dažiem prettuberkulozes līdzekļiem.

Ir atzīts, ka M. tuberculosis kompleksa mikobaktēriju primārā identifikācija no ne-tuberkulozes mikobaktērijām tiek veikta pēc šādām īpašībām: augšanas ātrums blīvā barības vielu vidē, pigmentu veidošanās, koloniju morfoloģija, skābju rezistences klātbūtne un augšanas optimālā temperatūra.

Diemžēl nav vienas laboratorijas metodes, kas varētu droši atšķirt M. tuberculosis kompleksa mikobaktērijas no citām skābi izturīgām mikobaktērijām; tomēr iepriekš aprakstīto pazīmju kombinācija ar vairāku turpmāk norādīto bioķīmisko testu rezultātiem ļauj identificēt M. tuberculosis kompleksa mikobaktērijas ar varbūtību līdz pat 95%.

Lai atšķirtu M. tuberculosis kompleksa mikobaktērijas (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovisBCG, M. africanum, M. microti, M. canettii un citas) no lēni augošām ne-tuberkulozes mikobaktērijām, tiek izmantoti pamata bioķīmiskie testi, lai noteiktu šādu pazīmju klātbūtni:

• spēja ražot nikotīnskābi (niacīna tests):
• nitrātu reduktāzes aktivitāte;
• termostabilā katalāze;
• augšana uz barotnes ar nātrija salicilātu (1 mg/ml).

Kā papildu testu var izmantot arī augšanas testus vidē, kas satur 500 μg/ml paranitrobenzoskābes vai 5 % nātrija hlorīda.

Daudzas bakterioloģiskās laboratorijas šos mikroorganismus identificē tikai sarežģītā līmenī, kas ir saistīts ar laboratoriju ierobežotajām iespējām un speciālistu metodoloģiskajām iespējām.

Praksē vairumā gadījumu M. tuberculosis un M. bovis diferenciācijai pietiek ar šādiem testiem: niacīnu, nitrātu reduktāzi, pirazinamidāzi un augšanas reģistrāciju vidē, kas satur 2 μg/ml tiofēn-2-karbonskābes hidrazīda. Tiek ņemts vērā, ka M. tuberculosis kompleksa mikobaktērijām raksturīgs šāds pazīmju kopums:

• lēna augšana (vairāk nekā 3 nedēļas);
• augšanas temperatūra 35–37 ^° C robežās;
• pigmentācijas trūkums (ziloņkaula krāsa);
• izteikta skābes izturīga krāsa;
• pozitīvs niacīna tests;
• pozitīvs nitrātu reduktāzes tests;
• termostabilas katalāzes trūkums (68 ^° C).
• augšanas trūkums uz Lovenšteina-Jensena barotnes, kas satur:
  • 1000 µg/ml nātrija salicilskābes,
  • 500 mkg/ml paranitrobenzoskābes,
  • 5% nātrija hlorīds:
• augšana 1–5 μg/ml tiofēn-2-karbonskābes klātbūtnē.

Izolētu mikobaktēriju diferenciācijas nozīme ievērojami palielināsies, pieaugot ar tuberkulozi vai mikobakteriozi saistītu HIV/AIDS gadījumu reģistrācijas biežumam. Pašlaik nav absolūtas pārliecības par praktisko reģionālo laboratoriju gatavību pareizi veikt šāda apjoma darbu.

[ 51 ], [ 52 ], [ 53 ], [ 54 ], [ 55 ], [ 56 ], [ 57 ], [ 58 ]

Tuberkulozes imunoloģiskā diagnostika

Pastāv vairākas universālas parādības, preparāti un imunoloģiskie testi, kas sākotnēji tika atklāti tieši tuberkulozes gadījumā vai imūnās atbildes uz mikobaktērijām modelī. Tie ietver BCG un tuberkulīnu, tādu parādību kā ādas DST (tuberkulīna testi - Pirkē un Mantū reakcijas), reakciju uz tuberkulīna subkutānu ievadīšanu sensibilizētiem dzīvniekiem (Koha fenomens). Dažas no pirmajām antivielām infekcijas slimību gadījumā tika atklātas arī tuberkulozē. Protams, jo dziļāka ir izpratne par prettuberkulozes imunitātes mehānismiem un to ģenētisko kontroli, jo plašāka var būt imunoloģisko metožu un preparātu, kas ietekmē imunitāti, izmantošana ftizioloģijas praktisko problēmu risināšanā.

Pašlaik vissvarīgākā un sarežģītākā praktiskā problēma tiek uzskatīta par tuberkulozes atklāšanu iedzīvotāju masveida skrīninga procesā. Tomēr, neskatoties uz daudzajiem ziņojumiem par "veiksmēm" (ierobežotā materiālā), nav nevienas imunoloģiskas metodes (reproducējamas "jebkurās rokās") vai zāles, kas būtu piemērotas šiem mērķiem.

Klīniskajā praksē plaši tiek izmantotas imunoloģiskās metodes, jo īpaši seroloģiskie pētījumi (antigēnu, antivielu noteikšana) un tuberkulīna provokācijas testi.

Seroloģiskās metodes, kas nosaka antigēnus un antivielas dažādās ķermeņa vidēs, ieņem pirmo vietu starp imunoloģiskajiem pētījumiem, ko izmanto diferenciāldiagnostikā.

Mikobaktēriju tuberkulozes antivielu noteikšanas specifika ir atkarīga no imūnanalīzē izmantotajiem antigēniem. Ir ierosināts ievērojams skaits antigēnu, no kuriem pirmais ir tuberkulīna PPD:

• PPD un citi kompleksi preparāti no kultūras šķidruma;
• ultraskaņas dezintegrants;
• Tritona ekstrakts un citi sarežģīti šūnu sieniņu preparāti;
• 5-antigēns (Daniels);
• 60-antigēns (kokcito);
• lipoarabinomanāns;
• nabassaites faktors (trehalozes-6,6-dimikolāts);
• fenola un citi glikolipīdi;
• lipopolisaharīdi;
• fibronektīnu saistošais antigēns;
• olbaltumvielas (visbiežāk rekombinantās); 81, 65, 38, 34, 30, 19, 18, 16, 15, 12 KDA utt.

Krievijas un ārvalstu zinātnieku daudzu gadu pētījumu rezultātā tika identificēti galvenie antivielu veidošanās modeļi un tuberkulozes seroloģiskās diagnostikas efektivitāte: jo sarežģītāks antigēns, jo augstāka ir jutība un zemāka testu specifiskums. Specifiskums dažādās valstīs atšķiras atkarībā no iedzīvotāju inficētības ar M. tuberculosis un ne-tuberkulozes mikobaktērijām, no BCG vakcinācijas utt. Bērniem serodiagnostikas informatīvums ir zemāks nekā pieaugušajiem. Primārās tuberkulozes gadījumā (biežāk bērniem) informatīvāks ir IgM noteikšana; sekundārās tuberkulozes gadījumā - IgG. HIV inficētiem cilvēkiem serodiagnostikas informatīvums antivielu noteikšanā ir samazināts. Antivielu noteikšanas efektivitāte ir atkarīga no vairākiem "klīniskiem momentiem": procesa aktivitātes (mikobaktēriju "izolācijas" klātbūtne vai neesamība, sabrukšanas dobumu klātbūtne, infiltrācijas pakāpe), procesa izplatības, tā gaitas ilguma.

Enzīmu imūnanalīzes (EIA) metodes jutība ir aptuveni 70%. Pētījuma nepietiekamā efektivitāte ir saistīta ar tā zemo specifiskumu. Iepriekš tika apsvērtas iespējas izmantot seroloģisko skrīningu augsta riska grupās, jo īpaši cilvēku vidū ar plaušu izmaiņām pēc tuberkulozes.

Lai palielinātu ELISA specifiskumu, tiek meklēti specifiskāki antigēni, tostarp tādi, kas iegūti ar gēnu inženierijas palīdzību: ESAT-6 u. c. (skatīt iepriekš). Stingri specifisku antigēnu (38 kDa, ESAT) izmantošana palielina specifiskumu, bet ievērojami samazina analīzes jutīgumu. Līdztekus ELISA (eksperimentālām laboratorijas testēšanas sistēmām, piemēram, Pathozyme ELISA komplektam) tiek piedāvāti arī imūnhromatogrāfiskie komplekti ar laterālo filtrāciju (Mycodot), kā arī citi līdzīgi testi (membrānas punktu analīze) ar testa rezultāta vizuālu novērtējumu. Veicot šos testus, analīze aizņem 10–30 minūtes; tiem nav nepieciešams īpašs aprīkojums, tie prasa rezultātu vizuālu novērtējumu, kas ir saistīts ar zināmu subjektivitāti. Šīm metodēm ir aptuveni tādas pašas jutīguma un specifiskuma īpašības (attiecīgi 70 % un 90–93 %) kā tradicionālajai ELISA.

Imūnanalīzes metožu izmantošanai ir zināma vērtība kā papildu metodei, kas tiek ņemta vērā tuberkulozes diferenciāldiagnozē izmantoto metožu kompleksā, īpaši tās ekstrapulmonālo formu diagnostikā. ELISA metode ir visefektīvākā tuberkulozā meningīta diagnostikā, pārbaudot cerebrospinālo šķidrumu. Šajā gadījumā analīzes jutība ir 80–85%, bet specifiskums – 97–98%. Ir informācija par antivielu noteikšanas efektivitāti pret Mycobacterium tuberculosis asaru šķidrumā tuberkulozā uveīta diagnostikā.

Gamma interferona sintēzes indukcija in vitro

Gamma interferons (IFN-γ) ir specifiskas imūnās aizsardzības faktors, kas tiek realizēts, aktivizējot makrofāgu enzīmu sistēmas. Sensibilizētu T limfocītu IFN-γ sintēzes indukciju izraisa to mijiedarbība ar mikobaktēriju antigēniem.

Kā antigēni tiek izmantots gan tuberkulīna PPD, gan specifiski antigēni, kas iegūti ar gēnu inženierijas palīdzību, jo īpaši ESAT-6 antigēns (agri sekrēts antigēns ar molekulmasu 6 kDa) un CFP-10 (kultūras filtrāta proteīns, 10 kDa). BCG vakcīnas un citu mikobaktēriju šūnās nav ģenētiski modificētu vai rekombinantu antigēnu. Lietojot tuberkulīnu, IFN-γ indukcijas testa rezultāti ir salīdzināmi ar tuberkulīna ādas testa rezultātiem (tieša korelācija). Lietojot ģenētiski modificētus antigēnus, testa rezultāti ir specifiskāki un nav atkarīgi no iepriekšējās BCG vakcinācijas. Pārbaudot vakcinētas personas, kurām nav bijis kontakts ar tuberkulozes infekciju, testa specifiskums ir 99%. Testa jutība tuberkulozes pacientu vidū svārstās no 81 līdz 89%.

Ir izstrādāti testi un diagnostikas metodes, kuru pamatā ir īslaicīga pilnasins šūnu vai no asinīm izolētu mononukleāro šūnu ar tuberkulozes mikobaktēriju antigēniem kultivēšana in vitro, kam seko IFN-γ koncentrācijas noteikšana vai IFN-γ sintezējošo T-limfocītu skaita skaitīšana. Mēģenē sintezētā interferona koncentrāciju nosaka ar ELISA metodi, izmantojot monoklonālās antivielas, kas saistās ar IFN-γ. Pēc tam, izmantojot standarta IFN-γ kalibrēšanu, nosaka tā koncentrāciju mēģenes vai plāksnes iedobēs.

Elispota testā uz trauka virsmas, kas pārklāta ar antivielām pret IFN-γ, tiek saskaitīts IFN-γ sintezējošo T šūnu skaits.

ASV Pārtikas un zāļu pārvaldes apstiprinātās in vitro IFN-γ indukcijas diagnostikas izstrādātāji apgalvo, ka tests nevar atšķirt latentu tuberkulozes infekciju no aktīvas tuberkulozes. Tādēļ reģionos ar augstu inficēšanās līmeni testam nav tiešas diagnostiskas vērtības. Tomēr mūsu valstī to var izmantot, lai atšķirtu bērnu tuberkulozes infekciju no alerģijas pēc vakcinācijas, kā arī lai novērtētu specifiskās imunitātes līmeni ārstēšanas laikā.

Pašlaik tiek pētīta vietējā testa sistēma IFN-γ sintēzes indukcijas noteikšanai ar specifiskiem tuberkulozes antigēniem in vitro.

Imūnsistēmas stāvoklis un tuberkulozes gaita, imūnkorekcija

Tuberkulozes ārstēšanas laikā cilvēkiem rodas izmaiņas antigēnijā un imūnsistēmas stāvoklī.

Dati par izmaiņām eksudātos un audos lielā mērā ir pretrunīgi. Vienīgais, ko var pilnībā pamatoti atzīmēt, ir tas, ka tuberkulozes granulomas parasti satur ievērojamu skaitu aktivētu T-limfocītu.

Ir lietderīgi pakavēties pie vēl diviem punktiem, kas ir nepieciešami, lai izprastu imunoloģisko mehānismu lomu tuberkulozes ārstēšanā cilvēkiem:

• AIDS pacientiem ir īpaši augsts vairāku zāļu rezistences attīstības risks;
• Vairāku zāļu rezistences gadījumā (un bez HIV infekcijas) imūnsistēmas traucējumi (galvenokārt T šūnu imunitāte) ir īpaši nozīmīgi.

Tuberkulozes gadījumā plaši tiek izmantotas dažādas imunokorekcijas metodes: pirmkārt, tās ir zāles, kas galvenokārt iedarbojas uz T-šūnu imunitāti un mononukleāro fagocītu sistēmu (aizkrūts dziedzera hormoni, izofons, likopīds, polioksidonijs utt.), kā arī uz veselām (novājinātām) mikobaktērijām un to sastāvdaļām.

Tuberkulozes molekulārā bioloģiskā diagnostika

Molekulārās bioloģijas metodes infekcijas slimību diagnostikā galvenokārt ietver metodes, kuru pamatā ir baktēriju un vīrusu patogēnu genoma materiālu manipulācija, lai identificētu specifisku ģenētisko materiālu - DNS sekcijas ar nukleotīdu secību, kas raksturīga noteiktai patogēna sugai vai celmam, lai analizētu specifiskas DNS secības gēnos, kas nosaka patogēna jutību pret noteiktām zālēm, kā arī lai analizētu noteiktu patogēna gēnu funkcionālo aktivitāti. Molekulārās bioloģijas metodes ir kļuvušas plaši izplatītas zinātniskajos pētījumos un praktiskajā pielietojumā dažādu baktēriju un vīrusu infekciju diagnostikā un uzraudzībā pēc tam, kad 1985. gadā Kerija Malisa (Nobela prēmijas laureāte, 1989) atklāja polimerāzes ķēdes reakciju.

Polimerāzes ķēdes reakcijas metodes principi un iespējas

PCR ļauj dažu stundu laikā miljoniem reižu amplificēt (reizināt) nukleotīdu secību (patogēna DNS fragmentu) mēģenē. Reakcijas veikšana atsevišķu DNS ķēžu klātbūtnē nosaka analīzes ārkārtīgi augsto jutību.

Dažu DNS ķēdes posmu nukleotīdu secība nosaka mikroorganisma ģenētisko unikalitāti, kas izskaidro PCR augsto specifiskumu.

Šīs metodes nozīme Mycobacterium tuberculosis noteikšanai un īpašību izpētei ir saistīta ar mikroorganisma bioloģiskajām īpašībām, kam ir ļoti lēna augšana: Mycobacterium tuberculosis DNS dubultošanās laiks to kultivēšanas laikā ir 12–24 stundas.

PCR metodes princips ir amplifikācija - vairākkārtēja, miljoniem reižu noteiktas DNS sekvences sekciju reizināšana mēģenes mikrotilpumā ar ciklisku šādu trīs reakcijas posmu atkārtošanos, no kuriem katrs notiek atšķirīgā temperatūras režīmā:

• I posms - divpavedienu DNS denaturācija karsējot ar tās ķēžu atšķirībām;
• II posms - praimeru (primējošo oligonukleotīdu) komplementāra saistīšanās (hibridizācija) ar stingri specifiska DNS fragmenta ķēžu gala sekcijām, kas atlasītas amplifikācijai;
• III posms – DNS fragmenta ķēdes pabeigšana, izmantojot termostabilo DNS polimerāzi.

Amplifikācijai mēģenē jābūt matricas DNS molekulām. Četru veidu deoksinukleozīdu trifosfāti (nukleotīdi), kas satur atbilstošās slāpekļa bāzes: adenīns (A), timīns (T), guanīns (G), citozīns (C); mākslīgi sintezēti primeri (praimeri), kas sastāv no 18-20 bāzes pāriem; termostabils enzīms DNS polimerāze ar temperatūras optimumu 68-72 ^° C un magnija joni.

PCR specifiskums ir atkarīgs no izvēlētā DNS fragmenta. Saskaņā ar to tiek sintezēti flanking primer oligonukleotīdi. Hibridizācijas un DNS ķēdes pabeigšanas specifiskumu nosaka šādu slāpekļa bāzu pāru komplementaritātes princips: adenīns-timīns, guanīns-citozīns.

Lai noteiktu tuberkulozes kompleksa mikobaktēriju genomu, vairumā testa sistēmu visefektīvākais amplifikācijas mērķis ir IS6110 DNS fragments, kuram vairumā tuberkulozes mikobaktēriju celmu ir ievērojams atkārtojumu skaits (10–20) genomā, kas līdztekus specifiskumam nodrošina arī augstu analīzes jutību. Vienlaikus ir aprakstīti tuberkulozes mikobaktēriju celmi ar nelielu atkārtojumu skaitu vai IS6110 fragmenta neesamību.

DNS molekulu ekstrakcija no bioloģiskā parauga

Lai veiktu PCR, patogēna DNS molekulas jāizolē no bioloģiskā materiāla minimālā tilpumā, ar minimālu nespecifiskas DNS daudzumu un dažādiem enzīma - DNS polimerāzes - inhibitoriem.

Paraugu sagatavošana jāveic apstākļos, kas novērš pētāmo paraugu savstarpēju piesārņošanu ar izolētām DNS molekulām. Tas prasa telpas iepriekšēju apstrādi ar ultravioleto gaismu, grīdu un galdu un ierīču darba virsmu apstrādi ar hloru saturošiem šķīdumiem. Tāpat nepieciešams izmantot tīrus cimdus, vienreizējās lietošanas mēģenes un automātisko pipešu uzgaļus.

Lai izolētu Mycobacterium tuberculosis DNS no klīniskiem paraugiem (cerebrospinālā šķidruma, bronhu skalošanas), kas nesatur lielu skaitu leikocītu, šūnu atlieku vai sāļu, pietiek paraugu centrifugēt ar 3–4 000 apgriezieniem minūtē, nogulsnēm pievienot 20–30 µl 2 % Triton X-100 šķīduma un karsēt 90 ^° C temperatūrā 30 minūtes.

Krēpu paraugu sagatavošanai nepieciešama efektīva sašķidināšana, parasti izmantojot 4% nātrija hidroksīdu un N-acetil-L-cisteīnu (NALC) pa 50–80 mg uz paraugu atkarībā no parauga viskozitātes. NALC šķīdums jāsagatavo ex tempore vai arī NALC pulveri var pievienot sausu tieši paraugam. Pēc sašķidināšanas paraugi jācentrifugē 15 minūtes ar 3500–4000 apgr./min (3000 g) 50 ml skrūvējamu vāciņu mēģenēs, t.i., tādos pašos apstākļos, kādi ieteicams krēpu sagatavošanai pirms kultivēšanas.

Lai iegūtu DNS no nogulsnēm, visbiežāk tiek izmantota metode, kuras pamatā ir 5-6 molāru guanidīna izotiocianāta šķīduma izmantošana kā lizējošais reaģents un mikroporainas silīcija oksīda daļiņas ("diatomīta zeme"), kas sorbē DNS molekulas. Nespecifiskas vielas, tostarp iespējamie inhibitori, pēc tam tiek mazgātas 2,5 molāru guanidīna izotiocianāta šķīdumā un etanola šķīdumā, pēc tam DNS molekulas tiek desorbētas ūdenī, un šie paraugi tiek izmantoti PCR veikšanai. Lai vienkāršotu DNS ekstrakcijas tehnoloģiju, "diatomīta zemi" bieži aizstāj ar magnētiskām mikrodaļiņām, kas pārklātas ar silīcija oksīdu. Šajā gadījumā daļiņu nogulsnēšanai centrifugēšanas vietā tiek izmantots īpašs magnētiskais statīvs mikromēģenēm.

Krievijā ir izstrādāta oriģināla mikobaktēriju imunomagnētiskās atdalīšanas metode ar sekojošu patogēna DNS ekstrakciju. Tuberkulozes mikobaktēriju imunomagnētiskajai atdalīšanai izmanto 3–5 μm lielas fero daļiņas, kas pārklātas ar silīcija oksīdu, pie kurām ar ķīmiskas saites palīdzību piestiprina poliklonālās (trušu) antivielas pret tuberkulozes mikobaktērijām. Krēpu paraugus pēc sārmainās līzes neitralizē ar skābu Tris-HCl šķīdumu un inkubē ar imunomagnētisku sorbentu. Pēc tam imunofero daļiņas savāc, izmantojot magnētisko stieni ar nomaināmu uzgali, pārnes mikromēģenē un nogulsnē. Pievieno 20–30 μl 2% Triton X-100 šķīduma un karsē 30 minūtes 90 ^° C temperatūrā. Supernatantu izmanto kā DNS matricu PCR analīzei.

Sarežģīta problēma ir tuberkulozes mikobaktēriju DNS ekstrakcija no biopsijas paraugiem. Biopsijas līzei izmanto enzīmu proteināzi K galīgajā koncentrācijā 200–500 mg/l 56 ^° C temperatūrā nakti. Pēc tam to ekstrahē, izmantojot vienu no zināmajām metodēm. Nespecifiskas DNS pārpalikums biopsijas paraugu PCR analīzē bieži izraisa reakcijas inhibīciju, kas prasa atkārtotu DNS ekstrakciju.

Rezultātu noteikšanas metodes

Pēc reakcijas pabeigšanas patogēna DNS amplificētie fragmenti tiek identificēti, izmantojot dažādas metodes.

Gēla elektroforēzes metode ir labi zināma. Šajā gadījumā iegūto DNS fragmentu identificē ar pozitīvu kontroli, kas satur vēlamo specifisko DNS fragmentu, vai ar iepriekš zināmu fragmenta izmēru (nukleotīdu pāru skaitu), ko nosaka, izmantojot standarta molekulāro marķieri.

Specifiskas krāsvielas - etīdija bromīda - klātbūtnē, kas ir iekļauta divpavedienu DNS sastāvā, sintezētais DNS fragments atklājas kā josla, kas mirdz ultravioletās gaismas ietekmē.

DNS fragmenta lielumam, kas noteikts ar elektroforēzi, pamatojoties uz nobraukto attālumu no sākuma, jāatbilst zināmam molekulmasas marķierim vai pozitīvajai kontrolei.

Citas PCR rezultātu noteikšanas metodes ir balstītas uz vienpavedienu PCR produktu hibridizāciju ar komplementāru oligonukleotīdu - DNS zondi, kas iezīmēta ar biotīnu, kam seko noteikšana, izmantojot fermentatīvu reakciju, piemēram, saistot streptavidīna-sārmainās fosfatāzes konjugātu ar biotīnu.

Pamatojoties uz šāda veida noteikšanu, ir izveidoti PCR analizatori, kuros PCR rezultātu noteikšana tiek veikta automātiski, nolasot paraugu optisko blīvumu pēc fermentatīvās reakcijas.

Šo metožu trūkumi ietver iespēju, ka laboratorijas ietvaros var rasties piesārņojums ar diezgan īsiem DNS molekulu fragmentiem. Kad šīs molekulas nonāk jaunatklātos paraugos, tās kļūst par PCR matricu un noved pie viltus pozitīviem rezultātiem.

Šajā sakarā, lai novērstu viltus pozitīvus rezultātus, tiek ieviesti stingri noteikumi telpu atdalīšanai un izolēšanai: DNS ekstrakcijai no bioloģiskajiem paraugiem; telpu rezultātu noteikšanai (elektroforēze) no tīrās zonas. Šīs telpas ir iespējama piesārņojuma zona. Vēl viena izolēta zona ir tīrā telpa pētāmo DNS paraugu ievadīšanai mēģenēs ar reakcijas maisījumu PCR veikšanai. Visbeidzot, tiek pieņemts, ka galvenā ierīce - DNS pastiprinātājs - jāiznes uz atsevišķu, iespējams, biroja telpu.

Lai novērstu piesārņojumu ar iepriekšējo reakciju produktiem - amplikoniem, dažas PCR testa sistēmas satur deoksinukleozīdu uridīnu deoksinukleozīda timidīna vietā, kas tiek iebūvēts atbilstošajā pozīcijā in vitro ķēdes sintēzes laikā, t.i., slāpekļa bāze timīns, kas atrodas dabiskajā DNS, tiek aizstāts ar uracilu. Uracila DNS glikozilāze, kas pievienota analizējamā materiāla reakcijas maisījumam, iznīcina tikai piesārņojošos fragmentus ar deoksiuridīnu, bet ne dabisko analizēto DNS, kas satur deoksitimidīnu. Turpmāka karsēšana 94 ^° C temperatūrā inaktivē šo enzīmu un netraucē amplifikāciju PCR.

Ir testa sistēma, kuras pamatā ir rRNS izotermiska amplifikācija, kurā vispirms tiek veikta DNS molekulu reversā transkripcija un sintēze, kas savukārt ir matrica turpmākajai RNS molekulu sintēzei. RNS amplikonus nosaka, izmantojot ar akridīnu iekrāsotu DNS zondi hibridizācijas laikā reakcijas mēģenes šķīdumā. Šai metodei papildus augstajai jutībai ir priekšrocība, ka analīze tiek veikta vienā mēģenē, kas novērš piesārņojumu. Pēc autoru domām, šīs metodes jutība elpceļu paraugos sasniedz 90% ar specifiskumu 99–100%.

Reālā laika PCR tiek ieviestas jaunas noteikšanas metodes. Šīs metodes galvenokārt atšķiras ar to, ka PCR un tās rezultātu noteikšana tiek veikta vienlaicīgi vienā slēgtā mēģenē. Tas ne tikai tehnoloģiski vienkāršo analīzes metodi, bet arī novērš laboratorijas telpu un paraugu piesārņošanu ar iepriekšējās PCR produktiem.

Reālā laika PCR rezultāti tiek noteikti ar fluorescenci, kas rodas, hibridizējot fluorogēnu DNS zondi ar specifisku DNS fragmentu, kas amplificēts PCR laikā. Fluorogēnu DNS zonžu struktūra ir konstruēta tā, ka fluorescences marķieris tiek atbrīvots fermentatīvas reakcijas rezultātā vai attālinās no fluorescences dzēšanas molekulas tikai pēc specifiskas hibridizācijas ar vēlamo DNS molekulu, kas amplificēta PCR laikā. Palielinoties ar zondi hibridizēto molekulu skaitam, fluorescences pieaugums līdz nosakāmam līmenim ir proporcionāls amplificētā produkta molekulu skaitam. Tā kā DNS fragmentu molekulu skaits katra PCR cikla laikā dubultojas, cikla numurs, no kura tiek noteikta un palielinās fluorescence, ir apgriezti proporcionāls DNS molekulu skaitam sākotnējā paraugā. Ja reakcijā kā kalibratoru ievada vairākas dažādas zināmas atbilstošā tuberkulozes mikobaktēriju DNS fragmenta molekulu koncentrācijas, tad DNS genomu skaitu pētāmā materiālā var aprēķināt, izmantojot datorprogrammu.

Katrs standarta paraugs tiek dublēts. Kvantitatīvais kritērijs ir minimālais PCR ciklu skaits, kas nepieciešams, lai sāktos un pieaugtu detektējama fluorescence. Abscisu ass ir ciklu skaits; ordinātu ass ir fluorescences vērtība. DNS koncentrācijas ir apgriezti proporcionālas ciklu skaitam, kas nepieciešams, lai parādītos fluorescence. Labās kolonnas logi (21–32) parāda atbilstošo koncentrāciju ciklu numurus. Atšķirības starp 10 reizes lielākām DNS fragmentu koncentrācijām 10² ^– 10³ ^ml ir 3,2–3,4 cikli. Diviem pacientiem IS6110 fragmentu koncentrācijas bija aptuveni 10³ ^/ ml un 10³ ^/ ml. Ņemot vērā analizēto fragmentu atkārtojumu skaitu (6–20) Mycobacterium tuberculosis genomā, Mycobacterium tuberculosis skaits klīniskajos paraugos ir attiecīgi aptuveni 100 un 1000 šūnas.

PCR pielietojums tuberkulozes diagnostikā

PCR metode visplašāk tiek izmantota tuberkulozes ātrai diagnostikai - Mycobacterium tuberculosis noteikšanai klīniskajos paraugos: krēpās, bronhu skalojumos, pleiras eksudātā, urīnā, cerebrospinālajā šķidrumā, osteolīzes punkcijas, sieviešu dzimumorgānu aspirātos un dažādās biopsijās. Pētījumā Nīderlandē, kurā tika analizēti aptuveni 500 krēpu un bronhu skalojuma paraugi no 340 pacientiem ar apstiprinātu plaušu tuberkulozes diagnozi, tika pētīta PCR, kultūras un uztriepes mikroskopijas metožu salīdzinošā jutība. Analīzes jutība bija attiecīgi 92,6, 88,9 un 52,4%. Visu metožu specifiskums bija aptuveni 99%.

Tika salīdzināta Mycobacterium tuberculosis noteikšanas efektivitāte, izmantojot uztriepes mikroskopiju, sēšanu uz Lovenšteina-Jensena barotnes, VASTES testa sistēmu un PCR analīzi. PCR uzrādīja jutību 74,4%, mikroskopija - 33,8%, sēšana uz cietas barotnes - 48,9% un VASTES - 55,8%. Vidējais noteikšanas laiks sēšanai uz Lovenšteina-Jensena barotnes ir 24 dienas. VASTES - 13 dienas, PCR - 1 diena.

Tiek apspriesta arī PCR izmantošanas iespēja kā jutīga un ātra metode tuberkulozes ārstēšanas efektivitātes uzraudzībai.

Mycobacterium tuberculosis DNS noteikšana ar PCR metodi ar efektīvu ķīmijterapiju tiek noteikta ilgākā laika periodā - vidēji 1,7 mēnešos, salīdzinot ar baktēriju ekskrēciju, kas noteikta ar fluorescences mikroskopiju, un 2,5 mēnešos, salīdzinot ar bakterioloģisko izmeklēšanu.

Ārpuspulmonālās tuberkulozes formu diagnostika

PCR kā jutīgas metodes nozīme ir īpaši liela ekstrapulmonālām formām, jo tieši šajās formās klīniskās un radioloģiskās metodes un tradicionālās bakterioloģiskās metodes Mycobacterium tuberculosis noteikšanai diagnostikas materiālos ir neefektīvas.

Izmeklējot urīna paraugus, PCR analīzes rezultāti bija pozitīvi 16 no 17 pacientiem ar aktīvu urīnceļu tuberkulozi un negatīvi 4 pacientiem ar neaktīvu nieru tuberkulozi un 39 pacientiem ar urīnceļu slimībām, kas nav tuberkulozes formas.

Tika pierādīta PCR analīzes efektivitāte kaulu smadzeņu aspirātu pētījumos pacientiem ar nezināmas ģenēzes drudzi un aizdomām par slimības tuberkulozu raksturu. Tuberkulozā limfadenīta diagnosticēšanai bērniem tika pētīti 102 punkcijas aspirāti un biopsijas paraugi no 67 bērniem ar aizdomām par tuberkulozu limfadenītu. Iegūti pozitīvi rezultāti: ar reālā laika PCR - 71,6%, fluorescences mikroskopiju - 46,3%, kultūras pētījumā - 41,8%. Pētot 50 limfmezglu biopsijas pacientiem ar kaķa skrāpējuma slimību, visi rezultāti bija negatīvi. Tādējādi tika pierādīta 100% PCR analīzes specifiskums. Tajā pašā darbā tika pierādīta M. avium noteikšanas iespēja limfmezglu punkcijas biopsijā.

Sieviešu dzimumorgānu tuberkulozes diagnostika neauglības gadījumā ir viena no sarežģītākajām diagnostikas problēmām. 14 (56%) no 25 laparoskopiski izmeklētām pacientēm ar aizdomām par tuberkulozi tika iegūti pozitīvi rezultāti endometrija biopsiju, endometrija aspirātu un Duglasa maisiņa šķidruma paraugu PCR pētījumos. Uztriepes mikroskopija un kultūras pētījumi deva attiecīgi 1 un 2 pozitīvus rezultātus. Arī šie gadījumi bija PCR pozitīvi. Lielākā daļa PCR pozitīvu rezultātu bija gadījumos ar tuberkulozes raksturīgajām pazīmēm saskaņā ar histoloģisko izmeklēšanu; mazāks skaits bija gadījumos ar aizdomām par tuberkulozi saskaņā ar laparoskopiju. Tikai viens pozitīvs PCR rezultāts tika iegūts, ja nebija laparoskopisku datu par tuberkulozi.

Diagnosticējot ekstrapulmonālas tuberkulozes formas, klīnicistiem bieži rodas jautājums par patogēna identificēšanas iespējām, izmeklējot asins paraugus, izmantojot PCR metodi. Literatūras dati liecina, ka Mycobacterium tuberculosis DNS noteikšana no asins paraugiem ir iespējama progresējošu HIV infekcijas formu gadījumā. Mycobacterium tuberculosis DNS tika atklāta tikai dažādu orgānu ģeneralizētas tuberkulozes gadījumā pacientiem ar transplantētu nieri un imūnsupresiju.

[ 59 ], [ 60 ], [ 61 ], [ 62 ], [ 63 ]

Mikobaktēriju sugu identifikācija

PCR metode var būt diezgan efektīva tuberkulozes kompleksa mikobaktēriju un dažu ne-tuberkulozes mikobaktēriju veidu ātrai identificēšanai pēc to primārās augšanas iegūšanas. Šajā gadījumā PCR izmantošana var ietaupīt 7–10 dienas, kas nepieciešamas pozitīva rezultāta turpmākai kultūras identifikācijai. PCR pētījums tehniski ir ļoti vienkāršs, jo tam nav nepieciešama sarežģīta klīniskā materiāla paraugu sagatavošana, lai sasniegtu augstu jutību. Pārbaudot 80 pozitīvas kultūras šādā testa sistēmā (MB BacT. by Organon), visi pozitīvie PCR analīzes rezultāti bija stingri specifiski un tika veikti 1 dienas laikā. Lai identificētu citus mikobaktēriju veidus, kad tie tiek iegūti kultūrā, patogēna DNS tiek hibridizēta ar specifiskām DNS zondēm, kas iezīmētas ar akridīnu, un celmi tiek noteikti pēc ķīmiskās luminiscences parādīšanās, izmantojot ķīmijuminescenci vai uz nitrocelulozes strēmelītēm, vizuāli novērtējot pēc hibridizācijas. Šis komplekts identificē ierobežotu sugu skaitu: Mycobacterium tuberculosis kompleksu, M. avium, M. avium kompleksu, M. kansasii un M. gordonae.

A. Telenti un līdzautori izstrādāja arī relatīvi vienkāršu un lētu metodi klīniski nozīmīgu mikobaktēriju sugu identificēšanai, pamatojoties uz PCR un sekojošu apstrādi ar diviem restrikcijas enzīmiem (enzīmiem, kuriem piemīt spēja pārgriezt DNS molekulu noteiktos punktos). Šajā gadījumā tiek amplificēts DNS fragments, kas kodē karstuma šoka proteīnu (65 kDa), pēc tam PCR iegūtais DNS fragments, kura izmērs ir 439 nukleotīdu pāri, tiek atsevišķi apstrādāts ar diviem enzīmiem - Bste II un Нае III. Pēc tam, izmantojot agarozes gela elektroforēzi, tiek analizēti divi iegūtie produkti, nosakot to izmērus (nukleotīdu pāru skaitu), izmantojot standarta DNS fragmentu (molekulāro DNS marķieru) komplektu no 100 līdz 1000 nukleotīdu pāriem garumā. Katrā no definētajām sugām (M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M.fortuitum) katram restrikcijas enzīmam tiek atrasti 2 vai 3 dažāda izmēra DNS fragmenti. Iegūto dažāda izmēra DNS fragmentu kombinācija ļauj šīs sugas atšķirt vienu no otras.

Tiek izstrādāta bioloģisko DNS mikročipu tehnoloģija, kas palīdzēs vienā pētījumā identificēt vairāk nekā 100 mikobaktēriju sugas.

Sugu identificēšanu var veikt arī, izmantojot 16S rRNS mainīgā reģiona PCR amplifikāciju, kam seko amplikonu sekvencēšana, salīdzinot ar atbilstošo primāro struktūru, kas ļauj identificēt vairāk nekā 40 mikobaktēriju sugas.

PCR var izmantot arī, lai identificētu sugas tuberkulozes mikobaktēriju kompleksā, tostarp diferenciāciju starp M. bovis un M. bovis BCG. To dara, analizējot noteiktu gēnu klātbūtni vai neesamību genoma reģionos RD1, RD9 un RD10. RD1 nav M. bovis BCG, bet ir sastopams virulentās sugās, tostarp M. bovis.

Mycobacterium tuberculosis zāļu jutības noteikšana, izmantojot PCR

Molekulārās ģenētiskās metodes uzdevumi Mycobacterium tuberculosis zāļu jutības vai rezistences noteikšanai ir samazināti līdz mutāciju identificēšanai noteiktās zināmu gēnu nukleotīdu sekvencēs. Galvenās metodes balstās vai nu uz šo sekvenču tiešu nolasīšanu (sekvencēšanu) pēc amplifikācijas, vai uz biotīnu iezīmētu DNS fragmentu hibridizāciju, kas amplificēti PCR laikā ar DNS zondēm. Abas iespējas ietver aizvietojumu identificēšanu nukleotīdu sekvencēs, kas, izmantojot DNS zondes, noved pie hibridizācijas neesamības vai nepilnīgas izmantošanas uz nitrocelulozes membrānas, izmantojot enzīmu konjugātu (streptavidīna-sārmainās fosfatāzes) - LIPA-Rif-TB metodi.

Metode fluorescences mērīšanai lokāli fiksētās DNS zondēs uz mikrorajoniem, kas ir komplementāri zināmām mutācijām PCR amplificētos gēnu reģionos, kas ir atbildīgi par zāļu jutību vai rezistenci, tiek saukta par mikrobiočipu metodi. Šī pētījuma veikšanas pamatalgoritms ir šāds. Pēc DNS izolēšanas no klīniskā parauga vai mikobaktēriju kultūras jāveic PCR, lai amplificētu atbilstošos groB gēna fragmentus, kas ir atbildīgi par zāļu jutību pret rifampicīnu, vai katG un inhA gēnus, kas kodē mikobaktēriju proteīnus, kas ir atbildīgi par jutību pret izoniazīdu. PCR rezultātus novērtē, izmantojot agarozes gela elektroforēzi, kas apstiprina atbilstošo vēlamā garuma DNS fragmentu saņemšanu. Pēc tam tiek veikta otrā PCR kārta, lai DNS ievadītu fluorescējošu marķējumu. PCR rezultātus vēlreiz apstiprina ar gēla elektroforēzi. Pēc tam tiek veikta hibridizācija (inkubācija nakti), kam seko iegūtā materiāla mazgāšana uz biočipa, kas ir liels skaits īsu DNS ķēžu (zonžu), kas fiksētas uz nelielas stikla plāksnes, kas ir komplementāras pret zālēm jutīgā tuberkulozes mikobaktēriju tipa nukleotīdu sekvencēm iespējamo mutāciju punktos. kā arī mutantu sekvencēm, kas ir atbildīgas par zāļu rezistenci. DNS zondu atrašanās vieta uz plāksnes ir stingri noteikta, un tiek noteikts hibridizācijas laikā novērotais fluorescences līmenis rezultāta noteikšanai, izmantojot īpašu nolasīšanas ierīci. Šajā sakarā analīzes rezultāti tiek noteikti, izmantojot īpašu datorprogrammu.

Pēdējos gados, pamatojoties uz reālā laika PCR tehnoloģiju, ir izstrādātas alternatīvas metodes Mycobacterium tuberculosis zāļu jutības noteikšanai, kas ļauj šos pētījumus veikt slēgtā mēģenes režīmā.

13.-13. attēlā parādīti Mycobacterium tuberculosis klīnisko kultūru analīzes rezultāti, nosakot zāļu rezistenci pret rifampicīnu, izmantojot reālā laika PCR: 218 - kontroles paraugs (jutīgs pret rifampicīnu); 93 - pozitīvā kontrole Ser-Trp TCG-TGG mutācijai; 4482 - pozitīvā kontrole Ser-Leu TCG-TTG mutācijai; 162-322 - eksperimentālie paraugi. 4 kanālu amplifikācijas kinētisko līkņu aprēķināšanas rezultāts: 1. kanāls: 393 - pozitīvā kontrole Ser-Trp TCG-TGG mutācijai; 2. kanāls: 4482 - pozitīvā kontrole Ser-Leu TCG-TTG mutācijai; 162, 163, 172, 295 - eksperimentālie paraugi; 4. kanāls: visu eksperimentā iesaistīto paraugu amplifikācijas kinētiskās līknes. Amplifikācijas reakcijas pozitīvā kontrole. Secinājumi: Analīzē tika atklātas šādas mutācijas, kas nosaka rezistenci pret rifampicīnu: paraugos 162, 163, 172, 295 - Ser-Leu TCG-TTG. Tas pats princips tika izmantots, lai noteiktu zāļu rezistenci pret izoniazīdu, izmantojot katG un inhA gēnus, kas nosaka visbiežāk sastopamās mutācijas.

[ 64 ], [ 65 ], [ 66 ], [ 67 ], [ 68 ], [ 69 ]

Mycobacterium tuberculosis celma identifikācija

Visvairāk pētītā Mycobacterium tuberculosis celmu identifikācijas metode ir tehnoloģija, ko sauc par restrikcijas fragmentu garuma polimorfismu (RFLP), un tās pamatā ir Mycobacterium tuberculosis DNS fragmentācija (restrikcija) ar enzīmu Pvu II un iegūto fragmentu sekojoša hibridizācija ar noteiktām specifiskām sekvencēm tā atkārtojuma elementa IS6110 DNS. Intraspecifiskā mainība rodas, pateicoties atšķirīgajam IS6110 atkārtojumu skaitam un to atrašanās vietai DNS, kā arī attālumu daudzveidībai starp noteiktiem restrikcijas enzīma uzbrukuma punktiem (restrikcijas vietām) un IS6110 elementu. Šī tehnoloģija ir ļoti sarežģīta un darbietilpīga. Pēc tam, kad no tuberkulozes mikobaktēriju kultūras izolētā DNS ir apstrādāta ar restrikcijas enzīmu, tiek veikta gēla elektroforēze, pēc tam dažāda garuma DNS fragmenti tiek pārnesti uz nitrocelulozes membrānu, hibridizēti ar IS6110 elementa fragmentiem, un rezultāti tiek noteikti, izmantojot fermentatīvu reakciju. Iegūtais specifiskais joslu raksts raksturo specifiska tuberkulozes mikobaktēriju celma DNS. Datoranalīze atklāj celmu identitāti vai radniecību. Lai gan RFLP metode ir visdiskriminējošākā, t. i., tā atklāj vislielāko atšķirību skaitu analizētajos celmos, tā ir neefektīva ar nelielu IS6110 atkārtojumu skaitu (mazāk nekā 5), kas novērots dažiem celmiem. 13.–14. attēlā parādīti celmu RFLP tipizācijas rezultāti.

Alternatīva var būt spoligotipa metode — DNS starpposma sekvenču polimorfisma analīze — starpposms starp DR reģiona tiešajiem atkārtojumiem. Veicot celmu spoligotipa noteikšanu, PCR tiek veikta ar praimeriem, kas ierobežo DR reģionu, pēc tam veidojas dažāda garuma fragmenti, kas hibridizējas ar mainīgiem DNS starpposma reģioniem. Pēc pētnieku domām, DR reģiona starpposma sekvenču analīze šķiet vienkāršāka, produktīvāka un piemērotāka celmu primārajai skrīningam un provizoriskai epidemioloģiskai analīzei, kā arī tiešai klīniskā materiāla izpētei.

Acīmredzot efektīvāka un tehnoloģiski pieejamāka metode ir VNTR (angļu vārdu saīsinājums) jeb metode, ar kuru nosaka mainīgo precīzu tandēma atkārtojumu skaitu tuberkulozes mikobaktēriju DNS. Šī metode balstās tikai uz PCR izmantošanu un neprasa papildu manipulācijas. Tā kā tandēma atkārtojumu skaits dažādos celmos un dažādos lokusos ir atšķirīgs, iegūtajā PCR produktu elektroforogrammā tiek noteikti un analizēti dažāda lieluma fragmenti. Pēc pētnieku domām, ar VNTR palīdzību tiek panākta lielāka celmu diferenciācijas pakāpe nekā ar RFLP metodi.

Pēdējos gados liela uzmanība ir pievērsta W-Beijing dzimtas Mycobacterium tuberculosis celmu (dažreiz sauktu par Pekinas celmu) izplatībai, kas lielākoties ir rezistenti pret zālēm.

Molekulārās bioloģijas pētījumu kvalitātes pamatprasības

[ 70 ], [ 71 ], [ 72 ], [ 73 ]

Galvenie normatīvie dokumenti PCR veikšanai

Krievijas Federācijas Veselības ministrijas rīkojumi: Nr. 45, 07.02.2000.; Nr. 109, 21.03.2003.; Nr. 64, 21.02.2000. Vadlīnijas: 1.3.1888-04 "Darba organizēšana, veicot PCR pētījumus ar materiālu, kas inficēts ar III-IV patogenitātes grupu patogēnajiem bioloģiskajiem aģentiem"; 1.3.1794-03 "Darba organizēšana, veicot PCR pētījumus ar materiālu, kas inficēts ar I-II patogenitātes grupu mikroorganismiem". 2003; 3.5.5.1034-01 "Ar I-IV patogenitātes grupu baktērijām inficēta testa materiāla dezinfekcija, strādājot ar PCR metodi", 2001. 11. pielikums Instrukcijām par vienotām mikrobioloģiskās izpētes metodēm tuberkulozes noteikšanā, diagnostikā un ārstēšanā.

[ 74 ], [ 75 ], [ 76 ]

Personāls

Molekulārās bioloģiskās izpētes var veikt klīniskās laboratorijas diagnostikas ārsti, bakteriologi, virusologi, klīniskās diagnostikas laboratorijas biologi, kā arī speciālisti ar vidējo medicīnisko izglītību, kuri ir ieguvuši specializāciju un tālākizglītību noteiktajā kārtībā.

Laboratorijas telpu iekārtošana

Ir nepieciešamas šādas laboratorijas iekārtas:

• Paraugu apstrādes zona - laboratorija, kas pielāgota darbam ar III-IV patogenitātes grupas infekcijas izraisītājiem, saskaņā ar Metodoloģiskajām vadlīnijām 13.1888-04.
• PCR reakcijas maisījumu sagatavošanas zona ir laboratorijas telpa, kas nodrošina aizsardzību pret iekšējo laboratorijas piesārņojumu - “tīra” zona.
• • Ja PCR produktu analīzei izmanto elektroforēzi vai hibridizāciju, laboratorijas telpai, kurā amplificētie DNS fragmenti tiek ekstrahēti no amplifikācijas mēģenes un attiecīgi var nonākt vidē, saskaņā ar PCR laboratoriju prasībām (Metodiskās vadlīnijas 1.3.1794-03, Metodiskās vadlīnijas 1.3.1888-04) jābūt pilnībā izolētai no iepriekšējos punktos norādītajām telpām. Jāizslēdz jebkāda personāla, aprīkojuma, jebkādu materiālu un priekšmetu pārvietošanās no elektroforēzes zonas uz paraugu apstrādes zonu un “tīro” zonu, kā arī gaisa pārvietošanās caur ventilācijas sistēmu vai caurvēja rezultātā. Šī zona nav nepieciešama PCR produktu fluorimetriskai noteikšanai.
• Rezultātu dokumentēšanas un apstrādes telpa ir aprīkota ar datoriem un nepieciešamo biroja aprīkojumu. Šajā telpā var atrasties aprīkojums, kas nodrošina PCR produktu noteikšanu, neatverot mēģeni. - fluorescējoši PCR detektori un termocikleri reāllaika PCR.

Sanitārās un epidemioloģiskās prasības krēpu primārajai apstrādei ir līdzīgas standarta mikrobioloģiskajām prasībām darbam ar Mycobacterium tuberculosis.

[ 77 ], [ 78 ], [ 79 ], [ 80 ]

Pilns laboratorijas aprīkojuma komplekts PCR diagnostikai

Laboratorijas komplektā ietilpst aprīkojums šādām telpām.

• paraugu sagatavošanas telpa, kurā atrodas šāds aprīkojums: II aizsardzības klases "SP-1.2" laminārās plūsmas pārsegs: cietvielu termostats ar apsildāmu vāku Eppendorf mēģenēm; mikrocentrifūga ar 13 000 apgr./min; centrifūga ("Vortex"); ledusskapis ar temperatūras diapazonu no -20 ^° C līdz +10 ^° C; mainīga tilpuma pipetes no "Proline" sērijas; sūknis ar uztvērējkolbu OM-1; pipešu statīvs; darba stacijas statīvs 200x0,5 ml; darba stacijas statīvs 50x1,5 ml; statīvi mēģenu glabāšanai 80x1,5 ml;
• reakcijas maisījuma sagatavošanas telpa: aizsargkamera PCR kaste ("Laminar-C. 110 cm); centrifūga "Vortex"; mainīga tilpuma pipetes no "Proline" sērijas; pipešu statīvs; darbstacijas statīvs 200x0,2 ml; statīvi mēģenu uzglabāšanai 80x1,5 ml; ledusskapis ar temperatūras diapazonu no -20 ^° C līdz +10 ^° C;
• Elektroforēzes telpa: horizontālā elektroforēzes kamera; barošanas avots; transilluminators;
• DNS pastiprinātājs vai nukleīnskābju analizators (reālā laika PCR) ar datoru un programmatūru; var novietot jebkurā pieejamā telpā. Ja tiek izmantota reālā laika PCR tehnoloģija, elektroforēzes telpa nav nepieciešama.

[ 81 ], [ 82 ], [ 83 ], [ 84 ]

Ārējā kvalitātes kontrole

Lai nodrošinātu objektīvi ticamu rezultātu iegūšanu, laboratorijām jāpiedalās laboratorijas pētījumu kvalitātes ārējās novērtēšanas sistēmā.

Kvalitātes kontroles sistēmas dalībnieki saņem: 12 ampulas ar liofilizētām baktēriju šūnu suspensijām, no kurām divas satur E. coli, 3 ampulas ar tuberkulozes mikobaktērijām (avirulentu celmu) koncentrācijā 102 ^/ ml; 3 ampulas ar līdzīga celma šūnām koncentrācijā 104 ^/ ml; 2 ampulas katrā ar ne-tuberkulozes mikobaktērijām M. avium-intracellulare un M. kansasii koncentrācijā 105 ^/ ml.

Ārējai kvalitātes novērtēšanai nosūtītie testi tiek iepriekš pārbaudīti divās neatkarīgās laboratorijās ar plašu pieredzi šajā jomā.

[ 85 ], [ 86 ]