Neironu cilmes šūnas

Eksperimentāli pierādījumi par CNS šūnu reģenerācijas iespējamību tika iegūti daudz agrāk nekā embrionālo cilmes šūnu atklāšana pētījumos, kas parādīja šūnu klātbūtni pieaugušu žurku smadzeņu neokorteksā, hipokampā un ožas sīpolos, kas uztver 3H-timidīnu, t.i., spēj sintēzes un dalīšanās procesā. Pagājušā gadsimta 60. gados tika pieņemts, ka šīs šūnas ir neironu priekšteči un ir tieši iesaistītas mācīšanās un atmiņas procesos. Nedaudz vēlāk tika atklāta de novo veidotu sinapšu klātbūtne uz neironiem, un parādījās pirmie darbi par embrionālo cilmes šūnu izmantošanu neiroģenēzes inducēšanai in vitro. 20. gadsimta beigās eksperimenti ar ESC virzītu diferenciāciju neironu cilmes šūnās, dopamīnerģiskos un serotonīnerģiskos neironos noveda pie klasisko ideju par zīdītāju nervu šūnu spēju atjaunoties pārskatīšanas. Daudzu pētījumu rezultāti pārliecinoši pierādīja gan neironu tīklu pārstrukturēšanas realitāti, gan neiroģenēzes klātbūtni visā zīdītāju organisma postnatālās dzīves periodā.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Neirālo cilmes šūnu avoti

Cilvēka neironu cilmes šūnas tiek izolētas operāciju laikā sānu kambara subventrikulārajā rajonā un hipokampa zobainajā vijumā, kuru šūnas kultūrā veido neirosfēras (nervu sfēras), un pēc pēdējo izkliedēšanas un preformācijas - visus galvenos centrālās nervu sistēmas šūnu tipus vai, īpašā vidē, jaunas mikrosfēras. Disociēto audu suspensijas kultūrās, kas izolētas no embrionālo smadzeņu periventrikulārajiem rajoniem, rodas arī neirosfēras.

Nenobriedušu smadzeņu šūnu marķieri ir nestīns, beta-tubulīns III (neironu līnijas marķieris), vimentīns, GFAP un NCAM, kas tiek identificēti imūncitoķīmiski, izmantojot monoklonālās antivielas. Nestīnu (IV tipa starpposma neirofilamentu proteīns) ekspresē multipotentas neiroektodermāla šūnas. Šo proteīnu izmanto, lai identificētu un izolētu multipotentas neiroepitēlija cilmes šūnas no CNS, izmantojot monoklonālās antivielas Rat-401, kas var noteikt līdz pat 95% neironu caurulīšu šūnu žurku embrijos vienpadsmitajā grūtniecības dienā. Nestīns netiek ekspresēts uz diferencētiem neironu cilmes šūnu pēcnācējiem, bet ir sastopams agrīnās neironu cilmes šūnās, postmitotiskajos neironos un agrīnajos neiroblastos. Šis marķieris ir izmantots, lai identificētu neiroepitēlija cilmes šūnas un pierādītu cilmes šūnu esamību CNS. Vimentīnu (III tipa starpposma neirofilamentu proteīns) ekspresē neironu un gliju cilmes šūnas, kā arī neironi, fibroblasti un gludās muskulatūras šūnas. Tādēļ abiem imūncitoķīmiskajiem marķieriem trūkst specifiskuma, kas nepieciešams, lai atsevišķi identificētu neironu cilmes šūnas un cilmes šūnas. Beta-tubulīns III nosaka cilmes šūnu diferenciācijas neironu virzienu, savukārt I tipa astrocītus identificē pēc GFAP ekspresijas, un oligodendrocīti specifiski ekspresē galaktocerebrosīdu (Ga!C).

FGF2 un EGF kalpo kā mitogēni neironu cilmes šūnām, atbalstot nediferencētu cilmes šūnu proliferāciju kultūrā ar neirosfēru veidošanos. Neirālo cilmes šūnu dalīšanās ātrums ievērojami palielinās FGF2 ietekmē, kā arī lietojot FGF2 + EGF kombināciju. FGF2 proliferatīvo iedarbību mediē FGF2-R1 receptori. Heparīns palielina FGF2 receptoru saistīšanās afinitāti un ievērojami pastiprina tā mitogēno iedarbību uz neiroepitēlija šūnām. Embrioģenēzes sākumposmā FGF2 receptori tiek ekspresēti žurku telencephalonā, savukārt vēlākos posmos to lokalizācija ir ierobežota ar ventrikulāro zonu. Postmitotisko šūnu FGF2-R1 ekspresijas maksimums tiek novērots pēc agrīnā neiroģenēzes perioda beigām. Telencephalona attīstības sākotnējam periodam raksturīgs zems EGF receptoru ekspresijas līmenis, galvenokārt ventrālā reģiona šūnās. Vēlākos embrioģenēzes posmos EGF-R ekspresija palielinās dorsālā virzienā. Grauzēju smadzenēs EGF ir augsta afinitāte pret transformējošā augšanas faktora beta receptoru (TGF-beta-R), ar kuru tas priekšroku saistās. Netiešus pierādījumus par EGF-R funkcionālo lomu sniedz dati par priekšsmadzeņu kortikālo disģenēzi, kas notiek embrioģenēzes un postnatālās ontoģenēzes vēlīnā periodā, samazinātu priekšsmadzeņu funkciju, kortikālo šūnu nāvi un hipokampālo ektopiju EGF receptoru gēnu izslēgšanas pelēm. Turklāt TGF-α klātbūtne barības vielu vidē ir absolūti nepieciešama neirosfēru veidošanai. Pēc augšanas faktoru izņemšanas no kondicionētās vides šūnas pārstāj dalīties un piedzīvo spontānu diferenciāciju, veidojoties neironiem, astrocītu un oligodendroblastu.

Ņemot to vērā, disociēto cilmes šūnu reaggregācija un neirosfēru kultivēšana tiek veikta barības vielu vidē, kas satur EGF un bāzisko FGF vai FGF2, bet bez seruma pievienošanas. Ir pierādīts, ka EGF inducē sānu kambara subependimālās zonas cilmes šūnu proliferāciju, un bāziskais FGF veicina nobriedušu smadzeņu striatuma, hipokampa, neokorteksa un redzes nerva cilmes šūnu proliferāciju. EGF un bāziskā FGF kombinācija ir absolūti nepieciešama cilmes šūnu, kas izolētas no priekšsmadzeņu trešā un ceturtā kambara ependimas, kā arī no krūšu kurvja un jostas daļas muguras smadzeņu mugurkaula kanāla, aktīvai proliferācijai.

Pēc disociācijas neironu cilmes šūnu suspensija tiek kultivēta plastmasas trauciņos vai daudzu iedobumu plāksnēs bez līmējoša substrāta, lai palielinātu jaunizveidoto neirosfēru izmēru, kas parasti aizņem apmēram 3 nedēļas. Neirosfēru daudzkārtējas izkliedēšanas un reprodukcijas metode ļauj iegūt pietiekamu skaitu lineāru multipotentu cilmes šūnu klonu intracerebrālai transplantācijai. Šis princips ir arī pamats cilmes šūnu bankas izveidei, kas izolētas no cilvēka embrionālām smadzenēm. To ilgstoša (vairāku gadu laikā) klonēšana ļauj iegūt stabilas neironu cilmes šūnu līnijas, no kurām inducētas diferenciācijas laikā veidojas kateholamīnerģiskie neironi.

Ja neirosfēras netiek izkliedētas un audzētas uz līmējošiem substrātiem vidē, kurā trūkst augšanas faktoru, proliferējošās cilmes šūnas sāk spontāni diferencēties, veidojot neironu un gliju prekursoršūnas, kas ekspresē visu veidu nervu šūnu marķierus: MAP2, Tau-1, NSE, NeuN, beta-tubulīns III (neironi), GFAP (astrocīti) un CalC, 04 (oligodendrocīti). Atšķirībā no peļu un žurku šūnām, neironi veido vairāk nekā 40% no visām diferencētajām šūnām cilvēka neironu cilmes šūnu kultūrās (no 1 līdz 5% grauzējiem), bet veidojas ievērojami mazāk oligodendrocītu, kas ir ļoti svarīgi no demielinizējošu slimību šūnu terapijas viedokļa. Problēma tiek atrisināta, pievienojot B104 barotni, kas stimulē mielīnu producējošu šūnu veidošanos.

Kultivējot cilvēka embriju smadzeņu neironu cilmes šūnas vidē, kas satur EGF, bāzisku FGF un LIF, neironu līnijas prekursoru šūnu skaits palielinās 10 miljonus reižu. Šūnas, kas audzētas in vitro, saglabā spēju migrēt un diferencēties neironu un gliju elementos pēc transplantācijas nobriedušu žurku smadzenēs. Tomēr in vivo multipotentu prekursoru šūnu dalīšanās skaits ir ierobežots. Vairākkārt ir atzīmēts, ka Heiflika robeža "pieaugušām" neironu cilmes šūnām (apmēram 50 mitozes) joprojām nav sasniedzama pat eksperimentā - šūnas neirosfēru formā saglabā savas īpašības tikai 7 mēnešus un tikai pēc 8 pasāžām. Tiek uzskatīts, ka tas ir saistīts ar to izkliedes metožu īpatnībām pasāžas laikā (tripsinizācija vai mehāniska iedarbība), kas strauji samazina šūnu proliferatīvo aktivitāti starpšūnu kontaktu traucējumu dēļ. Patiešām, ja dispersijas vietā tiek izmantota neirosfēru sadalīšanas 4 daļās metode, šūnu dzīvotspēja pasāžas laikā ievērojami palielinās. Šī metode ļauj kultivēt cilvēka neironu cilmes šūnas 300 dienas. Tomēr pēc šī perioda šūnas zaudē mitotisko aktivitāti un deģenerējas vai nonāk spontānas diferenciācijas stadijā, veidojoties neironiem un astrocītum. Pamatojoties uz to, autors uzskata, ka 30 mitozes ir maksimālais dalīšanās skaits kultivētām neironu cilmes šūnām.

Kultivējot cilvēka neironu cilmes šūnas in vitro, galvenokārt veidojas GABAerģiskie neironi. Bez īpašiem apstākļiem neironu cilmes šūnas tikai pirmajās pārejās rada dopamīnerģiskos neironus (kas nepieciešami Parkinsona slimības šūnu terapijai), pēc tam visi neironi kultūrā sastāv tikai no GABAerģiskām šūnām. Grauzējiem IL-1 un IL-11, kā arī nervu šūnu membrānu fragmenti LIF un GDNF izraisa dopamīnerģisko neironu indukciju in vitro. Tomēr šī metodoloģiskā pieeja cilvēkiem ir izrādījusies neveiksmīga. Tomēr, kad GABAerģiskie neironi tiek transplantēti intracerebrāli in vivo, mikrovides faktoru ietekmē rodas nervu šūnas ar dažādiem mediatoru fenotipiem.

Neirotrofisko faktoru kombināciju meklējumi parādīja, ka FGF2 un IL-1 inducē dopamīnerģisku neiroblastu veidošanos, kas tomēr nespēj producēt dopamīnerģiskus neironus. Hipokampālo cilmes šūnu diferenciācija ierosinošos glutamāterģiskos un inhibējošos GABA-erģiskos neironos notiek neirotrofīnu ietekmē, un EGF un IGF1 inducē glutamāterģisko un GABA-erģisko neironu veidošanos no cilvēka embriju neironu cilmes šūnām. Retīnskābes un neirotrofīna 3 (NT3) secīga pievienošana kultūrai ievērojami palielina nobriedušu smadzeņu hipokampālo cilmes šūnu diferenciāciju dažāda mediatora rakstura neironos, savukārt no smadzenēm iegūtā neirotrofiskā faktora (BNDF), NT3 un GDNF kombinācija var radīt piramīdveida neironus hipokampālā un neokortikālā kultūrā.

Tādējādi daudzu pētījumu rezultāti liecina, ka, pirmkārt, cilmes šūnas no dažādām smadzeņu struktūrām lokālu specifisku audu faktoru ietekmē spēj in vivo diferencēties par šīm struktūrām raksturīgiem neironu fenotipiem. Otrkārt, mērķtiecīga inducēta neironu cilmes šūnu diferenciācija in vitro, izmantojot cilmes šūnu klonēšanu, ļauj iegūt nervu un glijas šūnas ar noteiktām fenotipiskām īpašībām intracerebrālai transplantācijai dažādās smadzeņu patoloģiju formās.

Nav šaubu, ka pluripotentās cilmes šūnas, kas izolētas no embrijiem vai pieauguša cilvēka CNS, var uzskatīt par jaunu neironu avotu un izmantot klīnikā neiroloģisku patoloģiju ārstēšanai. Tomēr galvenais šķērslis praktiskas šūnu neirotransplantācijas attīstībai ir fakts, ka lielākā daļa neironu cilmes šūnu pēc implantācijas nobriedušas CNS neirogēnās zonās nediferencējas par neironiem. Lai pārvarētu šo šķērsli, tiek piedāvāta ļoti oriģināla inovatīva metode, kas ļauj in vitro iegūt tīru neironu populāciju no cilvēka augļa neironu cilmes šūnām pēc transplantācijas nobriedušas žurkas CNS. Autori pierāda, ka ar šo metodi implantēto šūnu diferenciācija beidzas ar holīnerģiskā fenotipa neironu veidošanos, kas ir saistīts ar apkārtējās mikrovides faktoru ietekmi. Piedāvātā tehnoloģija ir interesanta no jauna veida cilmes šūnu terapijas izstrādes un traumu vai neirodeģeneratīvu slimību dēļ bojātu neironu aizstāšanas viedokļa, jo holīnerģiskajiem neironiem ir vadošā loma motorisko, atmiņas un mācīšanās funkciju attīstībā. Jo īpaši no cilvēka cilmes šūnām izolētus holīnerģiskos neironus var izmantot, lai aizstātu amiotrofiskās laterālās sklerozes vai muguras smadzeņu traumu gadījumā zaudētos motoros neironus. Pašlaik nav informācijas par metodēm, kā no mitogēnu iepriekš veidotu cilmes šūnu populācijas iegūt ievērojamu skaitu holīnerģisku neironu. Autori piedāvā diezgan vienkāršu, bet efektīvu metodi, kā stimulēt mitogēnu iepriekš veidotas primārās cilvēka embrionālās neirālās cilmes šūnas, lai tās attīstītos par praktiski tīriem neironiem pēc implantācijas gan neirogēnās, gan neirogēnās nobriedušas žurkas CNS zonās. Viņu darba svarīgākais rezultāts ir pietiekami liela skaita transplantēto šūnu pārvēršana par holīnerģiskiem neironiem, implantējot tās vidējā membrānā un muguras smadzenēs.

Turklāt, lai in vitro no 8 nedēļu veca cilvēka embrionālā smadzeņu garozas veidotu neironu cilmes šūnas par holīnerģiskiem neironiem, tiek ierosināts izmantot dažādas šādu trofisko faktoru un ķīmisko elementu kombinācijas: rekombinants bāziskais FGF, EGF, LIF, peles aminoterminālais skaņas peptīds (Shh-N), trans-retīnskābe, NGF, BDNF, NT3, NT4, dabīgais laminīns un peles heparīns. Cilvēka neironu cilmes šūnu sākotnējā līnija (K048) tika uzturēta in vitro divus gadus un izturēja 85 pasāžas bez izmaiņām proliferācijas un diferenciācijas īpašībās, vienlaikus saglabājot normālu diploīdo kariotipu. 19.–55. pasāžas (38.–52. nedēļa) neizkliedētas neirosfēras tika uzklātas uz poli-d-lizīna un laminīna un pēc tam apstrādātas ar iepriekš minētajiem faktoriem dažādās koncentrācijās, kombinācijās un secībās. Bāziskā FGF, heparīna un laminīna (saīsināti FHL) kombinācija deva unikālu efektu. Pēc vienas dienas ilgas embrionālo neironu cilmes šūnu kultivēšanas FHL vidē ar vai bez Shh-N (Shh-N + FHL kombinācija saīsinājumā SFHL) tika novērota strauja lielu plakņu šūnu proliferācija. Visi pārējie vienas dienas protokoli (piemēram, bāziskais FGF + laminīns), gluži pretēji, izraisīja ierobežotu vārpstveida šūnu radiālu izplatīšanos, un šīs šūnas neatstāja neirosfēru kodolu. Pēc 6 aktivācijas dienām un sekojošām 10 diferenciācijas dienām B27 saturošā vidē FHL aktivēto sfēru malās tika konstatētas lielas multipolāras neironiem līdzīgas šūnas. Citās protokolu grupās lielākā daļa neironiem līdzīgo šūnu palika mazas un bipolāras vai unipolāras. Imunocitoķīmiskā analīze parādīja, ka mazas (< 20 μm) bipolāras vai unipolāras šūnas bija vai nu GABAerģiskas, vai glutamāterģiskas, savukārt lielākā daļa lielo multipolāro šūnu, kas lokalizējās FHL aktivēto neirosfēru malās, bija holīnerģiskas, ekspresējot holīnerģiskiem neironiem raksturīgus marķierus (Islet-1 un ChAT). Daži no šiem neironiem vienlaikus ekspresēja sinapsīnu 1. Piecu neatkarīgu eksperimentu sēriju rezultātā autori atklāja, ka kopējā šūnu populācija vienslāņa zonās diferencējās par TuJ1+ neironiem par 45,5%, savukārt holīnerģiskie (ChAT^) neironi veidoja tikai 27,8% no tās pašas populācijas šūnām. Pēc 10 dienu papildu diferenciācijas in vitro papildus holīnerģiskajiem neironiem FHL aktivētajās neirosfērās tika atrasts ievērojams skaits mazu neironu - glutamāterģiskie (6,3%), GABA-erģiskie (11,3%), kā arī astrocīti (35,2%) un nestīna pozitīvās šūnas (18,9%). Izmantojot citas augšanas faktoru kombinācijas, holīnerģiskie neironi nebija sastopami, un neirosfēru marginālās šūnas veidoja vai nu astrocītus, vai mazus glutamāterģiskus un GABA-erģiskus neironus. Rezerves un aktīvā potenciāla monitorēšana, izmantojot veselu šūnu plāksteru skavas tehniku, parādīja, ka pēc septiņām FHL aktivācijas dienām lielākajai daļai lielo polipolāro šūnu miera potenciāls bija -29,0±2,0 mV bez darbības potenciāla. Pēc 2 nedēļām miera potenciāls palielinājās līdz -63.6±3,0 mV, un depolarizējošo strāvu indukcijas brīdī tika novēroti darbības potenciāli, kurus bloķēja 1 M tetrodotoksīns, kas norāda uz holīnerģisko nenobriedušu neironu funkcionālo aktivitāti.

Autori arī konstatēja, ka FHL vai SFHL aktivācija in vitro pati par sevi neizraisa nobriedušu neironu veidošanos, un mēģināja noskaidrot, vai FHL vai SFHL iepriekš veidotās cilmes šūnas spēj diferencēties par holīnerģiskiem neironiem, ja tās tiek transplantētas nobriedušu žurku CNS. Šim nolūkam aktivētās šūnas tika injicētas neirogēnajā zonā (hipokampā) un vairākās neirogēnās zonās, tostarp pieaugušu žurku prefrontālajā garozā, vidējā membrānā un muguras smadzenēs. Implantētās šūnas tika izsekotas, izmantojot CAO-^^p vektoru. Ir zināms, ka OCP iezīmē gan šūnu ultrastruktūru, gan šūnu procesus (molekulārā līmenī) bez noplūdes, un to var tieši vizualizēt. Turklāt ar OCP iezīmētās neironu cilmes šūnas saglabā neironu un gliju diferenciācijas profilu, kas ir identisks embrionālo smadzeņu netransformēto cilmes šūnu profilam.

^{Vienu līdz divas nedēļas pēc 5 x 104} aktivētu un iezīmētu neironu cilmes šūnu implantācijas tās tika atrastas žurku muguras smadzenēs vai galvas smadzenēs, un OCD+ šūnas galvenokārt atradās injekcijas vietas tuvumā. Migrācijas un integrācijas procesi tika novēroti jau mēnesi pēc transplantācijas. Migrācijas robežas atšķīrās atkarībā no injekcijas vietas: injicējot prefrontālajā garozā, OCD+ šūnas atradās 0,4–2 mm attālumā no injekcijas vietas, savukārt implantācijas gadījumā vidējā membrānā, hipokampā vai muguras smadzenēs šūnas migrēja daudz lielākos attālumos – līdz pat 1–2 cm. Transplantētās šūnas bija lokalizētas augsti organizētās CNS struktūrās, tostarp frontālajā garozā, vidējā membrānā, hipokampā un muguras smadzenēs. OCD iezīmēti neironu elementi bija redzami jau pirmajā nedēļā pēc transplantācijas, un to skaits ievērojami palielinājās mēnesi pēc operācijas. Stereoloģiskā analīze uzrādīja augstāku implantēto šūnu izdzīvošanas līmeni dažādās smadzeņu struktūrās, salīdzinot ar muguras smadzenēm.

Ir zināms, ka vairumā pieauguša zīdītāja organisma audu saglabājas reģionālo cilmes šūnu populācija, kuru pārveidošanos par nobriedušām šūnām regulē specifiski audu faktori. Cilmes šūnu proliferācija, cilmes šūnu diferenciācija un konkrētai smadzeņu struktūrai raksturīgu neironu fenotipu veidošanās in vivo daudz lielākā mērā izpaužas embrionālajās smadzenēs, ko nosaka lokālās mikrovides morfogēnisko faktoru - neirotrofīnu BDNF, NGF, NT3, NT4/5 un augšanas faktoru FGF2, TGF-a, IGF1, GNDF, PDGF - augsta koncentrācija.

Kur atrodas neironu cilmes šūnas?

Ir noskaidrots, ka neirālās cilmes šūnas ekspresē glijas skābo fibrilāro proteīnu, kas starp nobriedušām neirālās līnijas šūnām tiek saglabāts tikai astrocītos. Tādēļ astrocītu šūnas varētu būt cilmes šūnu rezerve nobriedušajā CNS. Patiešām, neironi, kuru izcelsme ir GFAP pozitīviem prekursoriem, tika identificēti ožas sīpolos un zobu girusā, kas ir pretrunā ar tradicionālajiem priekšstatiem par radiālās glijas cilmes šūnu cilmes šūnu lomu, kas pieaugušo vecumā neizpauž GFAP zobu girusā. Iespējams, ka CNS ir divas cilmes šūnu populācijas.

Arī cilmes šūnu lokalizācijas jautājums subventrikulārajā zonā joprojām paliek neskaidrs. Pēc dažu autoru domām, ependimālās šūnas kultūrā veido sfēriskus klonus, kas nav īsti neirosfēras (piemēram, subependimālo šūnu kloni), jo tie spēj diferencēties tikai astrocītos. Savukārt pēc ependimālo šūnu fluorescējošas vai vīrusu marķēšanas marķieris tiek atklāts subependimālā slāņa un ožas sīpolu šūnās. Šādas marķētas šūnas in vitro veido neirosfēras un diferencējas neironos, astrocītos un oligodendrocītos. Turklāt ir pierādīts, ka aptuveni 5% šūnu ependīmā ekspresē cilmes marķierus - nestīnu, Notch-1 un Mussashi-1. Tiek pieņemts, ka asimetriskās mitozes mehānisms ir saistīts ar membrānas receptora Notch-1 nevienmērīgu sadalījumu, kā rezultātā pēdējais paliek uz meitas šūnas membrānas, kas lokalizēta ependimālajā zonā, savukārt mātes šūna, kas migrē uz subependimālo slāni, zaudē šo receptoru. No šī viedokļa subependimālo zonu var uzskatīt par neironu un gliju progenitoru prekursoru savācēju, kas veidojas no ependimālā slāņa cilmes šūnām. Saskaņā ar citu autoru uzskatiem, subventrikulārās zonas kaudālajās daļās veidojas tikai gliju šūnas, un neiroģenēzes avots ir rostrāllaterālās daļas šūnas. Trešajā variantā sānu kambaru subventrikulārās zonas priekšējai un aizmugurējai daļai tiek piešķirts līdzvērtīgs neirogēnais potenciāls.

Vēlams šķiet ceturtais centrālās nervu sistēmas cilmes rezerves organizācijas variants, saskaņā ar kuru subventrikulārajā zonā izšķir trīs galvenos neironu cilmes šūnu veidus - A, B un C. A šūnas ekspresē agrīnos neironu marķierus (PSA-NCAM, TuJl) un tās ieskauj B šūnas, kuras pēc antigēnu ekspresijas identificē kā astrocītus. C šūnām, kurām nav neironu vai gliju antigēnu īpašību, ir augsta proliferatīvā aktivitāte. Autors ir pārliecinoši pierādījis, ka B šūnas ir ožas sīpolu A šūnu un de novo neironu priekšteči. Migrācijas laikā A šūnas ieskauj neironu cilmes šūnu dzīslas, kas būtiski atšķiras no postmitotisko neiroblastu migrācijas mehānisma gar radiālo gliju embrionālās smadzenēs. Migrācija beidzas ožas sīpolos ar gan A, gan B šūnu mitotisku dalīšanos, kuru atvasinājumi tiek iekļauti granulārajos šūnu slāņos un smadzeņu ožas zonas glomerulārajā slānī.

Attīstošajām embrionālajām smadzenēm trūkst diferencētu ependimālo šūnu, un kambaru sieniņās ir proliferējošas kambaru germinālās un subventrikulārās zonas cilmes šūnas, kur migrē primārie neiro- un glioblasti. Pamatojoties uz to, daži autori uzskata, ka nobriedušu smadzeņu subependimālajā reģionā ir reducēti embrionālie germinālie neironu audi, kas sastāv no astrocītiem, neiroblastiem un neidentificētām šūnām. Patiesas neironu cilmes šūnas veido mazāk nekā 1% no šūnām sānu kambara sienas germinālajā zonā. Daļēji šī iemesla dēļ, kā arī saistībā ar datiem, ka subependimālās zonas astrocīti ir neironu cilmes šūnu priekšteči, nav izslēgta astrocītu gliālo elementu transdiferenciācijas iespēja, iegūstot neironu fenotipiskās īpašības.

Galvenais šķērslis neirālo cilmes šūnu lokalizācijas problēmas galīgam risinājumam in vivo ir specifisku marķieru trūkums šīm šūnām. Tomēr no praktiskā viedokļa ļoti interesanti ir ziņojumi, ka neirālās cilmes šūnas ir izolētas no CNS reģioniem, kas nesatur subependimālās zonas - priekšsmadzeņu trešā un ceturtā kambara, muguras smadzeņu krūšu kurvja un jostas daļas mugurkaula kanāla. Īpaši svarīgi ir fakts, ka muguras smadzeņu bojājums palielina centrālā kanāla ependimālo cilmes šūnu proliferāciju, veidojoties cilmes šūnām, kas migrē un diferencējas gliomesodermālās rētas astrocītos. Turklāt astro- un oligodendrocītu prekursoršūnas tika atrastas arī pieaugušu žurku nebojātās muguras smadzenēs.

Tādējādi literatūras dati pārliecinoši pierāda reģionālās stumbra rezerves klātbūtni pieaugušu zīdītāju, tostarp cilvēku, CNS, kuras reģeneratīvi plastiskā kapacitāte diemžēl spēj nodrošināt tikai fizioloģiskās reģenerācijas procesus ar jaunu neironu tīklu veidošanos, bet neapmierina reparatīvās reģenerācijas vajadzības. Tas rada uzdevumu meklēt iespējas palielināt CNS stumbra resursus ar eksogēniem līdzekļiem, kas nav atrisināms bez skaidras CNS veidošanās mehānismu izpratnes embrionālajā periodā.

Mūsdienās mēs zinām, ka embrionālās attīstības laikā neironu caurulītes cilmes šūnas ir trīs šūnu tipu - neironu, astrocītu un oligodendrocītu - avots, t.i., neironi un neiroglija rodas no vienas priekšteča šūnas. Ektodermas diferenciācija neironu cilmes šūnu klasteros sākas bHLH dzimtas proneurālo gēnu produktu ietekmē un tiek bloķēta ar Notch dzimtas gēnu receptoru transmembrānu proteīnu atvasinājumu ekspresiju, kas ierobežo neironu priekšteču šūnu noteikšanu un agrīnu diferenciāciju. Savukārt Notch receptoru ligandi ir blakus esošo šūnu transmembrānu Delta proteīni, kuru ekstracelulārā domēna dēļ tiek veikti tieši starpšūnu kontakti ar induktīvu mijiedarbību starp cilmes šūnām.

Embrionālās neiroģenēzes programmas tālāka īstenošana ir ne mazāk sarežģīta un, šķiet, tai vajadzētu būt sugai specifiskai. Tomēr neiroksenotransplantācijas pētījumu rezultāti liecina, ka cilmes šūnām piemīt izteikts evolūcijas konservatīvisms, kura dēļ cilvēka neironu cilmes šūnas spēj migrēt un attīstīties, transplantējot tās žurkas smadzenēs.

Ir zināms, ka zīdītāju CNS ir ārkārtīgi zema reparatīvās reģenerācijas spēja, ko raksturo tas, ka nobriedušās smadzenēs nav nekādu jaunu šūnu elementu parādīšanās pazīmju, lai aizstātu neironus, kas bojā traumas rezultātā. Tomēr neiroblastu transplantācijas gadījumā pēdējie ne tikai iesakņojas, proliferējas un diferencējas, bet arī spēj integrēties smadzeņu struktūrās un funkcionāli aizstāt zaudētos neironus. Transplantējot iesaistītās neironu cilmes šūnas, terapeitiskais efekts bija ievērojami vājāks. Ir pierādīts, ka šādām šūnām ir zema migrācijas spēja. Turklāt neironu cilmes šūnas neatveido neironu tīklu arhitektūru un nav funkcionāli integrētas recipienta smadzenēs. Šajā sakarā aktīvi tiek pētīti reparatīvi plastiskās reģenerācijas jautājumi nepreformētu multipotentu neironu cilmes šūnu transplantācijas laikā.

M. Aleksandrovas u.c. (2001) pētījumā pirmajā eksperimentu versijā recipienti bija seksuāli nobriedušas žurku mātītes, bet donori bija 15 dienas veci embriji. Recipientiem tika izņemta smadzeņu pakauša garozas daļa, un dobumā tika transplantēti mehāniski suspendēti iespējamā embrionālā garozas audi, kas saturēja ventrikulārā un subventrikulārā reģiona multipotentās cilmes šūnas. Otrajā eksperimentu versijā 9 nedēļu veca cilvēka embrija neirālās cilmes šūnas tika transplantētas seksuāli nobriedušu žurku smadzenēs. Autori izolēja audu gabaliņus no embrionālo smadzeņu periventrikulārā reģiona, ievietoja tos F-12 barības vielu vidē un, atkārtoti pipetējot, ieguva šūnu suspensiju, pēc tam kultivēja tos īpašā NPBM vidē, pievienojot augšanas faktorus - FGF, EGF un NGF. Šūnas tika audzētas suspensijas kultūrā, līdz izveidojās neirosfēras, kuras tika izkliedētas un atkal ievietotas kultūrā. Pēc 4 pārejām ar kopējo kultivēšanas periodu 12-16 dienas šūnas tika izmantotas transplantācijai. Recipienti bija desmit dienas veci žurku mazuļi un seksuāli nobriedušas divus mēnešus vecas Wistar žurkas, kurām smadzeņu laterālajā kambarī bez imūnsupresijas tika ievadīti 4 μl cilvēka neironu cilmes šūnu suspensijas. Darba rezultāti parādīja, ka žurku smadzeņu garozas embrionālā anlāža kambara un subventrikulārās zonas disociētās šūnas turpināja attīstīties allotransplantācijas laikā nobriedušās smadzenēs, t.i., diferencēto recipienta smadzeņu mikrovides faktori nebloķēja embrija neironu cilmes šūnu augšanu un diferenciāciju. Agrīnās stadijās pēc transplantācijas multipotentās šūnas turpināja mitotisku dalīšanos un aktīvi migrēja no transplantācijas zonas uz recipienta smadzeņu audiem. Transplantētas embrionālās šūnas ar milzīgu migrācijas potenciālu tika atrastas gandrīz visos recipienta smadzeņu garozas slāņos gar transplantācijas ceļu un baltajā vielā. Nervu šūnu migrācijas trakta garums vienmēr bija ievērojami īsāks (līdz 680 μm) nekā gliālo elementu garums (līdz 3 mm). Smadzeņu asinsvadi un šķiedru struktūras kalpoja par strukturāliem vektoriem astrocītu migrācijai, kas tika atzīmēts arī citos pētījumos.

Iepriekš tika uzskatīts, ka iezīmētu astrocītu uzkrāšanās recipienta smadzeņu garozas bojājuma zonā var būt saistīta ar gliālās barjeras veidošanos starp transplantāta un recipienta audiem. Tomēr kompakti novietotu šūnu transplantātu struktūras pētījums parādīja, ka to citoarhitektūrai raksturīgs haoss, bez jebkāda transplantēto šūnu slāņaina sadalījuma. Transplantēto neironu sakārtotības pakāpe tuvojās normālu smadzeņu garozas šūnu sakārtotības pakāpei tikai tad, ja starp donora un recipienta audiem nebija gliālās barjeras. Pretējā gadījumā transplantēto šūnu struktūra bija netipiska, un paši neironi bija pakļauti hipertrofijai. Izmantojot transplantēto šūnu neiroimūnķīmisko tipizāciju, transplantātos tika atrasti inhibējoši GABA-erģiskie neironi un tika noteikta PARV, CALB un NPY proteīnu ekspresija. Līdz ar to nobriedušās smadzenes saglabā mikrovides faktorus, kas spēj atbalstīt neironu multipotentu šūnu proliferāciju, migrāciju un specifisku diferenciāciju.

Cilvēka cilmes šūnu kultūrā, kas izolētas no 9 nedēļu vecu embriju smadzeņu periventrikulārā reģiona, M. Aleksandrova et al. (2001) ceturtajā pasāžā atrada lielu skaitu nestīna-pozitīvu multipotentu šūnu, no kurām dažas jau bija diferencējušās in vitro un attīstījās atbilstoši neironu tipam, kas atbilda citu autoru pētījumu rezultātiem. Pēc transplantācijas pieaugušu žurku smadzenēs kultivētās cilvēka cilmes šūnas mitotiski sadalījās un migrēja ksenogēno recipienta smadzeņu audos. Šūnu transplantācijās autori novēroja divas šūnu populācijas - mazas un lielākas. Pēdējās migrēja gan parenhīmā, gan pa recipienta smadzeņu šķiedru struktūrām nelielos attālumos - 300 μm robežās. Vislielākais migrācijas ceļa garums (līdz 3 mm) bija raksturīgs mazām šūnām, no kurām dažas diferencējās astrocītos, kas tika noteikts, izmantojot monoklonālās antivielas pret GFAP. Abi šūnu tipi tika atrasti sānu kambara sienā, kas norāda, ka transplantētās šūnas iekļuva rostrālajā migrācijas traktā. Gan cilvēku, gan žurku neironu cilmes šūnu astrocītu atvasinājumi galvenokārt migrēja caur recipienta smadzeņu asins kapilāriem un šķiedru struktūrām, kas sakrīt ar citu autoru datiem.

Cilvēka cilmes šūnu diferenciācijas analīze in vivo, izmantojot monoklonālās antivielas pret GFAP, CALB un VIM, atklāja gan astrocītu, gan neironu veidošanos. Atšķirībā no žurku transplantātu šūnām, daudzas cilvēka cilmes šūnas bija vimentīna pozitīvas. Līdz ar to dažas no cilvēka multipotentajām šūnām netika pakļautas diferenciācijai. Tie paši autori vēlāk parādīja, ka cilvēka neironu cilmes šūnas, kas transplantētas bez imūnsupresijas, izdzīvo žurku smadzenēs 20 dienas pēc transplantācijas, bez imūnās agresijas pazīmēm no nobriedušu smadzeņu gliālo elementu puses.

Ir noskaidrots, ka pat Drosophila neironālās cilmes šūnas iesakņojas un diferencējas tāda taksona smadzenēs, kas ir tik tālu no kukaiņiem kā žurka. Autoru eksperimenta pareizība nav apšaubāma: transgēnās Drosophila līnijas saturēja cilvēka neirotrofisko faktoru NGF, GDNF, BDNF gēnus, kas bija ievietoti CaSper vektorā zem Drosophila karstuma šoka promotera, tāpēc zīdītāju ķermeņa temperatūra automātiski izraisīja to ekspresiju. Autori identificēja Drosophila šūnas pēc baktēriju galaktozidāzes gēna produkta, izmantojot histoķīmisku X-Gal krāsošanu. Turklāt izrādījās, ka Drosophila neironālās cilmes šūnas specifiski reaģē uz neirotrofiskajiem faktoriem, ko kodē cilvēka gēni: ksenotransplantējot transgēnās Drosophila līnijas šūnas, kas satur gdnf gēnu, tās diferencējošajās neironālajās cilmes šūnās strauji palielinājās tirozīna hidroksilāzes sintēze, un šūnas ar ngf gēnu aktīvi producēja acetilholīnesterāzi. Ksenotransplantācija izraisīja līdzīgas gēnu atkarīgas reakcijas kopā ar to transplantēto embriju neironu audu allotransplantācijā.

Vai tas nozīmē, ka specifisku neironu cilmes šūnu diferenciāciju inducē sugai nespecifiski neirotrofiskie faktori? Saskaņā ar autoru rezultātiem, ksenotransplantātiem, kas ražo neirotrofiskos faktorus, bija specifiska ietekme uz allotransplantātu likteni, kas šajā gadījumā attīstījās intensīvāk un bija 2-3 reizes lielāki nekā allotransplantāti, kas tika ievadīti smadzenēs bez ksenotransplantātu pievienošanas. Līdz ar to ksenotransplantātu šūnām, kas satur neirotrofīnu gēnus, jo īpaši gēnu, kas kodē cilvēka gliālo šūnu neirotrofisko faktoru (GDNF), ir sugai nespecifiska ietekme uz allotransplantāta attīstību, līdzīga atbilstošā neirotrofīna iedarbībai. Ir zināms, ka GDNF palielina dopamīnerģisko neironu izdzīvošanu žurku embrionālajās vidussmadzenēs un uzlabo dopamīna metabolismu šajās šūnās, kā arī inducē tirozīna hidroksilāzes pozitīvu šūnu diferenciāciju, veicinot aksonu augšanu un palielinot neironu šūnu ķermeņa izmēru. Līdzīga ietekme tiek novērota arī kultivētos žurku vidussmadzeņu dopamīnerģiskajos neironos.

Pēc ksenotransplantācijas nobriedušu žurku smadzenēs tiek novērota aktīva cilvēka neironu cilmes šūnu migrācija. Ir zināms, ka neironu cilmes šūnu migrācijas un diferenciācijas procesu kontrolē īpašu gēnu kopums. Migrācijas sākuma signālu priekšteča šūnai, lai sāktu diferenciāciju, dod c-ret protoonkogēna proteīna produkts kopā ar GDNF. Nākamais signāls nāk no mash-1 gēna, kas kontrolē šūnas attīstības ceļa izvēli. Turklāt diferencējošo šūnu specifiskā reakcija ir atkarīga arī no ciliārā neirotrofiskā faktora α-receptora. Tādējādi, ņemot vērā ksenogēno cilvēka neironu cilmes šūnu un recipienta žurku smadzeņu šūnu pilnīgi atšķirīgo ģenētisko konstitūciju, ir jāatzīst ne tikai neirotrofisko faktoru sugas nespecifiskums, bet arī augstākais evolūcijas konservatīvisms gēnos, kas ir atbildīgi par neironu cilmes elementu specifisko diferenciāciju.

Nākotne rādīs, vai embrionālā neiromateriāla ksenotransplantācija būs iespējama neiroķirurģiskajā praksē, ārstējot neirodeģeneratīvus patoloģiskus procesus, ko izraisa mielīna sintēzes traucējumi oligodendrocītos. Tikmēr visintensīvāk risinātie neirotransplantācijas jautājumi ir saistīti ar allogēnu neironu cilmes šūnu iegūšanu no embrionālām vai nobriedušām smadzenēm kultūrā ar to sekojošu virzītu diferenciāciju neiroblastos vai specializētos neironos.

Neirālo cilmes šūnu transplantācija

Lai stimulētu pieauguša organisma neironu cilmes šūnu proliferāciju un diferenciāciju, var transplantēt embrionālos nervu audus. Iespējams, ka ar allotransplantātu ienestās embrionālo nervu audu cilmes šūnas pašas var proliferēties un diferencēties. Ir zināms, ka pēc mugurkaula traumas nervu vadītāju reģenerācija notiek, pagarinoties bojātajiem aksoniem un izaugot motoro neironu nebojātajiem izaugumiem, veidojot kolaterālas dīgstus. Galvenie faktori, kas kavē muguras smadzeņu reģenerāciju, ir saistaudu rētas veidošanās bojājuma zonā, distrofiskas un deģeneratīvas izmaiņas centrālajos neironos, NGF deficīts un mielīna sabrukšanas produktu klātbūtne bojājuma zonā. Ir pierādīts, ka dažādu šūnu tipu - pieaugušu dzīvnieku sēžas nerva fragmentu, embrionālā pakauša garozas, hipokampa, muguras smadzeņu, Švana šūnu, astrocītu, mikrogliju, makrofāgu, fibroblastu - transplantācija bojātajās muguras smadzenēs veicina bojāto aksonu reģenerāciju, izaugot, un ļauj jaunizveidotajiem aksoniem augt caur muguras smadzeņu bojājuma zonu. Eksperimentāli pierādīts, ka embrionālo nervu audu transplantācija muguras smadzeņu bojājuma zonā, neirotrofisku faktoru ietekmē, paātrina bojāto aksonu augšanu, novērš gliālo rētu veidošanos un distrofisku un deģeneratīvu procesu attīstību centrālajos neironos, savukārt transplantēto embrionālo nervu audu šūnas izdzīvo muguras smadzenēs, integrējas ar blakus esošajiem audiem un veicina aksonu augšanu caur bojājuma zonu, veidojoties dendrītiskām sinapsēm uz mugurkaula neironiem.

Šī reģeneratīvi plastiskās medicīnas joma Ukrainā ir guvusi vislielāko attīstību, pateicoties V. I. Cimbaljuka vadītās zinātniskās komandas darbam. Pirmkārt, tie ir eksperimentāli pētījumi par embrionālo nervu audu transplantācijas efektivitāti muguras smadzeņu traumu gadījumā. Perifērā nerva autotransplantācijas laikā autori novēroja visizteiktākās destruktīvās izmaiņas distālajā šuves zonā, kur 30. dienā pēc operācijas tās tika apvienotas ar reparatīviem procesiem. Allotransplantācijas laikā implantētā nerva morfofunkcionālajam stāvoklim 30. dienā bija raksturīga izteikta destruktija ar taukaino deģenerāciju un amiloidozi uz fokālas iekaisuma limfoīdo šūnu infiltrācijas fona ar dominējošu Švana šūnu atrofiju. Embrionālo nervu audu transplantācija lielākā mērā veicināja muguras smadzeņu vadītspējas atjaunošanos, īpaši dzīvniekiem, kuriem ķirurģiska iejaukšanās tika veikta pirmajās 24 stundās pēc traumas: uz iekaisuma un destruktīvo procesu intensitātes samazināšanās fona tika novērota mugurkaula neironu proteīnus sintezējošo un enerģiju ražojošo ultrastrukturālo elementu hipertrofija un hiperplāzija, oligodendrocītu hipertrofija un hiperplāzija, muskuļu darbības potenciāla amplitūda atjaunojās par 50% un impulsa vadīšanas ātrums par 90%. Novērtējot embrionālo nervu audu transplantācijas efektivitāti atkarībā no transplantācijas zonas, tika konstatēts, ka labākie rezultāti tika novēroti, ja transplantāts tika ievadīts tieši muguras smadzeņu traumas zonā. Pilnībā transektējot muguras smadzenes, embrionālo nervu audu transplantācija bija neefektīva. Dinamiskie pētījumi liecina, ka optimālais laiks embrionālo nervu audu transplantācijas veikšanai ir pirmās 24 stundas pēc muguras smadzeņu traumas, savukārt ķirurģiskas iejaukšanās veikšana izteiktu sekundāru išēmisku-iekaisuma izmaiņu periodā, kas rodas 2.-9. dienā pēc traumas, jāuzskata par nepiemērotu.

Ir zināms, ka smaga traumatiska smadzeņu trauma pēctraumatiskā perioda sākotnējā un starpposmā izraisa spēcīgu un ilgstošu lipīdu peroksidācijas aktivāciju gan bojātajos smadzeņu audos, gan organismā kopumā, kā arī izjauc enerģijas metabolisma procesus bojātajās smadzenēs. Šādos apstākļos embrionālo nervu audu transplantācija traumas zonā veicina lipīdu peroksidācijas procesu stabilizāciju un palielina smadzeņu un visa organisma antioksidantu sistēmas potenciālu, pastiprina tās antiradikālo aizsardzību pēctraumatiskā perioda 35.–60. dienā. Tajā pašā periodā pēc embrionālo nervu audu transplantācijas smadzenēs normalizējas enerģijas metabolisma un oksidatīvās fosforilēšanās procesi. Turklāt ir pierādīts, ka pirmajā dienā pēc eksperimentālas traumatiskas smadzeņu traumas bojātās puslodes audu impedance samazinās par 30–37%, kontralaterālās – par 20%, kas norāda uz ģeneralizētas smadzeņu tūskas attīstību. Dzīvniekiem, kuriem tika veikta embrionālo nervu audu transplantācija, tūskas involūcija notika ievērojami ātrāk - jau septītajā dienā ievainotās puslodes audu vidējā impedances vērtība sasniedza 97,8% no kontroles līmeņa. Turklāt pilnīga impedances vērtību atjaunošanās 30. dienā tika novērota tikai dzīvniekiem, kuriem tika veikta embrionālo nervu audu transplantācija.

Dažu neironu bojāeja smadzenēs pēc smagas galvaskausa-smadzeņu traumas ir viens no galvenajiem posttraumatisko komplikāciju cēloņiem. Vidussmadzeņu un iegarenās smadzenes integrējošo dopamīnerģisko un noradrenerģisko sistēmu neironi ir īpaši jutīgi pret traumām. Dopamīna līmeņa samazināšanās striopallidālajā kompleksā un smadzeņu garozā ievērojami palielina motorisko traucējumu un garīgo traucējumu, epileptiformu stāvokļu attīstības risku, un dopamīna ražošanas samazināšanās hipotalāmā var būt daudzu veģetatīvo un somatisko traucējumu cēlonis, kas novēroti vēlīnā pēctraumatiskā periodā. Pētījumu rezultāti, kas veikti eksperimentālas galvaskausa-smadzeņu traumas gadījumā, liecina, ka embrionālo nervu audu transplantācija palīdz atjaunot dopamīna līmeni bojātajā smadzeņu puslodē, dopamīna un norepinefrīna līmeni hipotalāmā, kā arī palielina norepinefrīna un dopamīna līmeni vidussmadzenēs un iegarenajās smadzenēs. Turklāt, embrionālo nervu audu transplantācijas rezultātā eksperimentālo dzīvnieku smadzeņu ievainotajā puslodē, fosfolipīdu procentuālā attiecība normalizējas un palielinās taukskābju saturs (C16:0, C17:0, C17:1, C18:0, C18:1 + C18:2, C20:3 + C20:4, C20:5).

Šie dati apstiprina transplantēto embrionālo nervu audu reģeneratīvi-plastisko procesu stimulēšanu un norāda uz transplantācijas reparatīvi-trofisko ietekmi uz recipienta smadzenēm kopumā.

Īpaši jāpievērš uzmanība Ukrainas Medicīnas zinātņu akadēmijas A. P. Romodanova Neiroķirurģijas institūta personāla klīniskajai pieredzei embrionālo nervu audu transplantācijā cerebrālās triekas gadījumā, kas ir ārkārtīgi sarežģīta patoloģija ar smagu motorisku disfunkciju. Cerebrālās triekas klīniskās formas ir atkarīgas no bojājumu līmeņa integrālajām struktūrām, kas ir atbildīgas par muskuļu tonusa regulēšanu un motorisko stereotipu veidošanos. Pašlaik ir pietiekami daudz pierādījumu, kas apstiprina faktu, ka patoloģiskām izmaiņām striopallidālajā-talamokortikālajā motorās kontroles sistēmā ir svarīga loma motorās funkcijas un muskuļu tonusa traucējumos. Šīs sistēmas striopallidālā saite veic kontroles funkciju, ražojot nigrostriatālu dopamīnu. Tiešais ceļš talamokortikālās kontroles īstenošanai sākas no putamena neironiem, to mediē gamma-aminosviestskābe (GABA) un viela P, un tas tiek projicēts tieši globus pallidus iekšējā segmenta un substantia nigra motoriskajā zonā. Netiešais ceļš, kura iedarbība tiek realizēta, piedaloties GABA un enkefalīnam, rodas no putamena neironiem un ietekmē bazālo gangliju kodolus caur virkni savienojumu, tostarp globus pallidus ārējo segmentu un subtalāma kodolu. Tiešā ceļa vadītspējas traucējumi izraisa hipokinēziju, savukārt netiešā ceļa struktūru vadītspējas samazināšanās noved pie hiperkinēzes ar atbilstošām muskuļu tonusa izmaiņām. GABAerģisko vadīšanas ceļu integritāte dažādos motorās kontroles sistēmas līmeņos un dopamīnerģisko savienojumu integrācija putamena līmenī ir būtiska talamokortikālo mijiedarbības regulēšanai. Visbiežākā motorās patoloģijas izpausme dažādās cerebrālās triekas formās ir muskuļu tonusa pārkāpums un cieši saistītas refleksīvās muskuļu aktivitātes izmaiņas.

Embrionālo nervu audu transplantācija cerebrālās triekas gadījumā prasa rūpīgu smadzeņu struktūru bojājumu rakstura analīzi. Pamatojoties uz dopamīna un GABA līmeņa noteikšanu subarahnoidālajā cerebrospinālajā šķidrumā, autori detalizēti aprakstīja funkcionālo smadzeņu struktūru integrācijas traucējumu līmeni, kas ļāva objektīvizēt ķirurģiskas iejaukšanās rezultātus un koriģēt atkārtotas neirotransplantācijas. Embrionālie nervu audi (9 nedēļu embrija aborta materiāls) tika transplantēti smadzeņu pusložu prekoncentrālo konvolūciju garozas parenhīmā atkarībā no atrofisko izmaiņu smaguma pakāpes. Pēcoperācijas periodā netika novērotas komplikācijas vai pacientu stāvokļa pasliktināšanās. Pozitīva dinamika tika novērota 63% pacientu ar spastiskām formām, 82% bērnu ar atoniski estētisko formu un tikai 24% pacientu ar jauktu slimības formu. Tika konstatēta augsta neirosensitizācijas līmeņa negatīva ietekme ar autoantivielu klātbūtni pret neirospecifiskiem proteīniem uz operācijas rezultātiem. Embrionālo nervu audu transplantācija izrādījās neefektīva pacientiem vecumā no 8 līdz 10 gadiem un vecākiem, kā arī smagas hiperkinētiskā sindroma un epilepsijas gadījumos. Klīniski embrionālo nervu audu transplantācijas efektivitāte pacientiem ar cerebrālās triekas spastiskām formām izpaudās jaunu statomotorisko prasmju un patvaļīgu kustību veidošanā ar patoloģiskā motoriskā stereotipa korekciju un spastiskuma pakāpes, patoloģisko stāju un attieksmes samazināšanos. Autori uzskata, ka embrionālo nervu audu transplantācijas pozitīvā ietekme ir normalizējošas ietekmes rezultāts uz supraspinālo struktūru funkcionālo aktivitāti, kas iesaistīta stājas tonusa un patvaļīgu kustību regulēšanā. Vienlaikus embrionālo nervu audu transplantācijas pozitīvo klīnisko ietekmi pavada neirotransmiteru satura samazināšanās subarahnoidālajā cerebrospinālajā šķidrumā, kas norāda uz skarto smadzeņu struktūru integrālās mijiedarbības atjaunošanos.

Pastāv vēl viena smaga neiroloģiskās patoloģijas forma - apallisks sindroms, kura ārstēšanas problēma diemžēl nebūt nav atrisināta. Apallisks sindroms ir polietioloģisks subakūts vai hronisks stāvoklis, kas rodas centrālās nervu sistēmas (galvenokārt smadzeņu garozas) smagu organisku bojājumu rezultātā, un to raksturo panapraksijas un panagnosijas attīstība ar relatīvi saglabātu smadzeņu segmentāli stumbra nodaļu un veidojumu funkciju. Turpmākie pētījumi (no 1 gada līdz 3 gadiem) ir parādījuši, ka apallisks sindroms nav galīga diagnoze par pastāvīgiem nervu sistēmas bojājumiem bērniem, bet gan pārvēršas vai nu organiskā demencē, vai hroniskā veģetatīvā stāvoklī. Ukrainas Medicīnas zinātņu akadēmijas A. P. Romodanova Neiroķirurģijas institūta Atjaunojošās neiroķirurģijas nodaļā 21 pacientam ar apalliska sindroma sekām tika veikta embrionālo nervu audu transplantācija. Vispārējā anestēzijā ar kroņa formas urbi tika izveidots urbums virs izteiktāko atrofisko izmaiņu zonas, kas atklātas datortomogrāfijas vai magnētiskās rezonanses attēlveidošanas laikā, un difūzas pelēkās vai baltās vielas atrofijas gadījumā transplantāts tika ievadīts smadzeņu prekontālajā un centrālajā giri. Pēc cietā smadzeņu apvalka atvēršanas, izmantojot speciālu ierīci, intrakortikāli tika implantēti audu gabaliņi no 8–9 nedēļu vecu embriju sensorimotorās garozas. Implantēto audu paraugu skaits svārstījās no 4 līdz 10, ko noteica urbuma lielums un lokālo izmaiņu lielums smadzeņu vielā. Atšķirībā no citiem patoloģiju veidiem, apalliskā sindroma gadījumā autori centās implantēt pēc iespējas vairāk embrionālo audu vispieejamākajās smadzeņu zonās. Dura mater tika sašūts, un tika veikta galvaskausa defekta plastiskā ķirurģija. Operācijas laikā visiem pacientiem novēroja būtiskas izmaiņas gan garozā (atrofija, konvolūciju neesamība, smadzeņu vielas krāsas un pulsācijas izmaiņas), gan smadzeņu apvalkos (dura mater sabiezējums, ievērojama arahnoidālās membrānas sabiezēšana ar savu asinsvadu klātbūtni, membrānu saplūšana ar pamatā esošo smadzeņu vielu). Šīs izmaiņas bija izteiktākas pacientiem ar iekaisīgiem smadzeņu bojājumiem anamnēzē. Pacientiem, kuriem bija bijusi CNS hipoksija, dominēja difūzas atrofiskas izmaiņas smadzeņu vielā, īpaši garozā, ar subarahnoidālās telpas palielināšanos, bez būtiskām izmaiņām smadzeņu apvalkos. Pusei pacientu bija pastiprināta mīksto audu, kaulu un smadzeņu vielas asiņošana. Pēc operācijām sešu mēnešu līdz trīs gadu laikā 16 pacientiem stāvoklis uzlabojās, bet pieciem pacientiem tas nemainījās. Pozitīva dinamika tika novērota gan motorajā, gan garīgajā sfērā. Muskuļu tonuss samazinājās desmit pacientiem, 11 pacientiem palielinājās motorā aktivitāte (samazinājās parēze,uzlabojās kustību koordinācija), pieciem bērniem ievērojami palielinājās augšējo ekstremitāšu manipulācijas spējas. Četriem pacientiem samazinājās epilepsijas lēkmju biežums un smagums, bet vienam bērnam visā novērošanas periodā pēc operācijas lēkmju nebija vispār. Diviem bērniem samazinājās agresija, diviem pacientiem ar smagiem bulbāriem traucējumiem uzlabojās rīšanas akts, divi bērni jau 2 nedēļas pēc operācijas spēja patstāvīgi košļāt. Tika novērota garīgo traucējumu smaguma samazināšanās, deviņi bērni pēc operācijas kļuva mierīgāki, septiņiem pacientiem uzlabojās miegs un uzmanība. Trīs pacienti ar apalliskā sindroma sekām sāka atpazīt savus vecākus, viens - izpildīt norādījumus, divi - izrunāt vārdus, trim samazinājās dizartrijas pakāpe. Autori norāda, ka manāms pacientu stāvokļa uzlabojums sākas 2 mēnešus pēc operācijas, sasniedz maksimumu 5-6 mēnešu laikā, pēc tam uzlabošanās temps palēninās un līdz gada beigām process stabilizējas 50% pacientu. Neirotransplantācijas pozitīvā ietekme kalpoja par pamatu atkārtotai operācijai sešiem pacientiem ar apalliskā sindroma sekām, bet uz otru smadzeņu puslodi. Otrās transplantācijas tehnika un metodes bija identiskas pirmajā operācijā izmantotajām, taču otrās operācijas klīniskais efekts bija zemāks, lai gan ne pēc pirmās, ne otrās ķirurģiskās iejaukšanās nopietnas komplikācijas neradās. Pēc autoru domām, neirotransplantācijas terapeitiskā efekta mehānisms ir saistīts ar transplantēto embrionālo nervu audu neirotrofisko efektu, kas satur lielu daudzumu augšanas, hormonālo un citu bioloģiski aktīvo vielu, kas stimulē bojāto neironu atjaunošanos un recipienta smadzeņu audu plastisko reorganizāciju. Iespējama arī aktivējoša ietekme uz iepriekš morfoloģiski saglabājušos, bet slimības dēļ funkcionālo aktivitāti zaudējušo nervu šūnu aktivitāti. Tieši straujā neirotrofiskā iedarbība var izskaidrot bulbāro funkciju uzlabošanos dažiem bērniem jau pirmās vai otrās nedēļas beigās pēc operācijas. Tiek pieņemts, ka papildus tam līdz trešajam vai ceturtajam mēnesim starp transplantātu un saimnieka smadzenēm tiek izveidoti morfofunkcionāli savienojumi, caur kuriem neirotransplantāts aizstāj mirušo smadzeņu šūnu funkcijas, kas ir substrāts gan pacientu motorisko, gan garīgo funkciju uzlabošanai. Divi bērni jau 2 nedēļas pēc operācijas spēja patstāvīgi košļāt. Tika novērota garīgo traucējumu smaguma samazināšanās, deviņi bērni pēc operācijas kļuva mierīgāki, septiņiem pacientiem uzlabojās miegs un uzmanība. Trīs pacienti ar apalliskā sindroma sekām sāka atpazīt savus vecākus, viens - sekot norādījumiem, divi - izrunāt vārdus,trijos gadījumos dizartrijas pakāpe samazinājās. Autori norāda, ka manāms pacientu stāvokļa uzlabojums sākas 2 mēnešus pēc operācijas, sasniedz maksimumu 5-6 mēnešu laikā, pēc tam uzlabošanās temps palēninās un līdz gada beigām process stabilizējas 50% pacientu. Neirotransplantācijas pozitīvā ietekme kalpoja par pamatu atkārtotai operācijai sešiem pacientiem ar apalliskā sindroma sekām, bet uz otru smadzeņu puslodi. Otrās transplantācijas tehnika un metode bija identiska pirmajai operācijai, bet otrās operācijas klīniskā iedarbība bija zemāka, lai gan pēc pirmās vai otrās ķirurģiskās iejaukšanās nebija nopietnu komplikāciju. Pēc autoru domām, neirotransplantācijas terapeitiskās iedarbības mehānisms ir saistīts ar transplantēto embrionālo nervu audu neirotrofisko efektu, kas satur lielu daudzumu augšanas, hormonālo un citu bioloģiski aktīvo vielu, kas stimulē bojāto neironu atjaunošanos un recipienta smadzeņu audu plastisko reorganizāciju. Iespējama arī aktivizējoša ietekme uz iepriekš morfoloģiski saglabājušos, bet slimības dēļ funkcionālo aktivitāti zaudējušo nervu šūnu aktivitāti. Tieši straujais neirotrofiskais efekts var izskaidrot bulbāro funkciju uzlabošanos dažiem bērniem jau pirmās vai otrās nedēļas beigās pēc operācijas. Tiek pieņemts, ka līdz ar to līdz trešajam vai ceturtajam mēnesim starp transplantātu un saimnieka smadzenēm tiek izveidoti morfofunkcionāli savienojumi, caur kuriem neirotransplantāts aizstāj mirušo smadzeņu šūnu funkcijas, kas ir substrāts gan pacientu motorisko, gan garīgo funkciju uzlabošanai. Divi bērni jau 2 nedēļas pēc operācijas spēja patstāvīgi košļāt. Tika novērota garīgo traucējumu smaguma samazināšanās, deviņi bērni pēc operācijas kļuva mierīgāki, septiņiem pacientiem uzlabojās miegs un uzmanība. Trīs pacienti ar apalliskā sindroma sekām sāka atpazīt savus vecākus, viens - izpildīt norādījumus, divi - izrunāt vārdus, trim samazinājās dizartrijas pakāpe. Autori norāda, ka manāms pacientu stāvokļa uzlabojums sākas 2 mēnešus pēc operācijas, sasniedz maksimumu 5-6 mēnešos, pēc tam uzlabošanās temps palēninās un līdz gada beigām process stabilizējas 50% pacientu. Neirotransplantācijas pozitīvā ietekme kalpoja par pamatu atkārtotai operācijai sešiem pacientiem ar apalliskā sindroma sekām, bet otrā smadzeņu puslodē. Otrās transplantācijas tehnika un metode bija identiska pirmajai operācijai, taču otrās operācijas klīniskais efekts bija zemāks, lai gan ne pēc pirmās, ne otrās ķirurģiskās iejaukšanās nebija nopietnu komplikāciju. Pēc autoru domām,Neirotransplantācijas terapeitiskā efekta mehānisms ir saistīts ar transplantēto embrionālo nervu audu neirotrofisko efektu, kas satur lielu daudzumu augšanas, hormonālo un citu bioloģiski aktīvo vielu, kas stimulē bojāto neironu atjaunošanos un recipienta smadzeņu audu plastisko reorganizāciju. Iespējama arī aktivizējoša iedarbība uz iepriekš morfoloģiski saglabājušos, bet slimības dēļ funkcionālo aktivitāti zaudējušo nervu šūnu aktivitāti. Tieši straujā neirotrofiskā iedarbība var izskaidrot bulbāro funkciju uzlabošanos dažiem bērniem jau pirmās vai otrās nedēļas beigās pēc operācijas. Tiek pieņemts, ka līdz ar to līdz trešajam vai ceturtajam mēnesim starp transplantātu un saimnieka smadzenēm tiek izveidoti morfofunkcionāli savienojumi, caur kuriem neirotransplantāts aizstāj mirušo smadzeņu šūnu funkcijas, kas ir substrāts gan pacientu motorisko, gan garīgo funkciju uzlabošanai, lai gan ne pēc pirmās, ne otrās ķirurģiskās iejaukšanās nopietnas komplikācijas neradās. Pēc autoru domām, neirotransplantācijas terapeitiskā efekta mehānisms ir saistīts ar transplantēto embrionālo nervu audu neirotrofisko efektu, kas satur lielu daudzumu augšanas, hormonālo un citu bioloģiski aktīvo vielu, kas stimulē bojāto neironu atjaunošanos un recipienta smadzeņu audu plastisko reorganizāciju. Iespējama arī aktivējoša ietekme uz iepriekš morfoloģiski saglabājušos, bet slimības dēļ funkcionālo aktivitāti zaudējušo nervu šūnu aktivitāti. Tieši straujā neirotrofiskā iedarbība var izskaidrot bulbāro funkciju uzlabošanos dažiem bērniem jau pirmās vai otrās nedēļas beigās pēc operācijas. Tiek pieņemts, ka līdz ar to līdz trešajam vai ceturtajam mēnesim starp transplantātu un saimnieka smadzenēm tiek izveidoti morfofunkcionāli savienojumi, caur kuriem neirotransplantāts aizstāj mirušo smadzeņu šūnu funkcijas, kas ir substrāts gan pacientu motorisko, gan garīgo funkciju uzlabošanai, lai gan ne pēc pirmās, ne otrās ķirurģiskās iejaukšanās nopietnas komplikācijas neradās. Pēc autoru domām, neirotransplantācijas terapeitiskās iedarbības mehānisms ir saistīts ar transplantēto embrionālo nervu audu neirotrofisko efektu, kas satur lielu daudzumu augšanas, hormonālo un citu bioloģiski aktīvo vielu, kas stimulē bojāto neironu atjaunošanos un recipienta smadzeņu audu plastisko reorganizāciju. Iespējama arī aktivējoša ietekme uz iepriekš morfoloģiski saglabājušos, bet slimības dēļ funkcionālo aktivitāti zaudējušo nervu šūnu aktivitāti.Tieši straujais neirotrofiskais efekts var izskaidrot bulbaru funkciju uzlabošanos dažiem bērniem jau pirmās vai otrās nedēļas beigās pēc operācijas. Tiek pieņemts, ka līdz ar to līdz trešajam vai ceturtajam mēnesim starp transplantātu un saimnieka smadzenēm tiek izveidoti morfofunkcionāli savienojumi, caur kuriem neirotransplantāts aizstāj mirušo smadzeņu šūnu funkcijas, kas ir substrāts gan pacientu motorisko, gan garīgo funkciju uzlabošanai.

Eksperimentāli tika pētīta embrionālo nervu audu transplantācijas ietekme uz starpneironālo savienojumu reorganizāciju. Autori, izmantojot fluorescējošu lipofīlu marķējumu DIL (1,1-dioktadecil-3,3,33'-tetrametilindokarbocianīna perhlorāts) un konfokālo lāzera skenēšanu, pētīja starpmodulāro aksonu savienojumu atjaunošanās modeļus smadzeņu garozas mehānisko bojājumu zonā ar un bez embrionālo nervu audu transplantācijas. Tika konstatēts, ka embrionālo nervu audu ievadīšana bojājuma zonā nodrošina aksonu augšanu, kas pēc iziešanas caur transplantātu savienojas ar blakus esošajiem smadzeņu audiem, savukārt bez embrionālo nervu audu transplantācijas bojājuma zona ir nepārvarams šķērslis augošiem aksoniem. Šajā darbā tika veikta embrionālā (15.–17. grūtniecības diena) neokorteksa transplantācija. Autoru iegūtie rezultāti ir vēl viens pierādījums embrionālo nervu audu transplantācijas aktīvajai ietekmei uz smadzeņu garozas blakus esošo strukturālo un funkcionālo moduļu starpneironālo attiecību posttraumatisko reorganizāciju. Embrionālo nervu audu transplantācija nodrošina daļēju savienojumu atjaunošanu starp smadzeņu garozas bojātajām zonām, radot labvēlīgus apstākļus aksonu augšanai transplantāta neirotrofisko faktoru darbības zonā. Šāda efekta esamība ir pierādīta eksperimentāli un literatūrā tiek apspriesta kā pierādījums seksuāli nobriedušu dzīvnieku bojāto smadzeņu augstajām plastiskajām spējām. Šajā sakarā šūnu transplantācija pašlaik tiek uzskatīta par optimālu terapeitisko stratēģiju bojātās cilvēka CNS funkciju atjaunošanai.

Autoru iegūtie dati par smadzeņu embrionālo nervu audu izmantošanas efektivitāti kā eksogēnu transplantācijas vidi aksonu augšanai apstiprina mērķtiecīgas komunikācijas saišu veidošanas perspektīvas starp neskartām blakus esošajām smadzeņu zonām. Darbs pie nervu audu transplantācijas ietekmes izpētes uz centrālās nervu sistēmas funkcionālo parametru dinamiku šķiet aktuāls. Darba uzdevums bija izpētīt embrionālā locus coeruleus (LC) transplantācijas ietekmi uz LC neironu morfofunkcionālajiem rādītājiem un recipientu lokomotoro aktivitāti. Recipienti bija Wistar žurku mātītes, bet donori bija 18 dienas veci tās pašas līnijas žurku embriji. Embrionālā LC transplantācija tika veikta smadzeņu trešā kambara dobumā. Histoloģiski transplantāta iesakņošanās tika konstatēta 75% recipientu dzīvnieku. Iesakņošanās gadījumos transplantāts atradās blakus kambara sienai, aizpildot 1/5-2/5 no tā lūmena, un bija dzīvotspējīgs. 1 un 6 mēnešus pēc operācijas transplantētie nervu audi atbilstoši to morfoloģiskajām īpašībām attēloja struktūras, kas būtu radušās to normālas ontoģenētiskās attīstības laikā, t.i., LC struktūras. Autoru iegūtie dati liecina, ka dzīvniekiem, kuriem tika transplantēta embrionālā LC anlāža, mainās dinamiskā aktivitāte un palielinās LC šūnu kodolu hromatīna matricas aktivitāte. Līdz ar to pastiprinās viņu pašu LC neironu aktivitāte, bet arī iesakņojies transplantāts ir funkcionāli aktīvs. Ir zināms, ka tā sauktais vidussmadzeņu lokomotorais reģions praktiski sakrīt ar LC lokalizāciju. Autori uzskata, ka recipientu žurku motorās aktivitātes izmaiņu pamatā ir gan pašu, gan transplantēto LC šūnu aktivācija, izdalot lielu daudzumu norepinefrīna, tostarp muguras smadzeņu segmentos. Tādējādi tiek pieņemts, ka motorās aktivitātes palielināšanās LC transplantācijas apstākļos dzīvnieku neskartās smadzenēs ir saistīta ar funkcionāli aktīva transplantāta klātbūtni, kas ir integrēts ar recipienta smadzenēm un veicina lokomotorās aktivitātes aktivizēšanos žurkām.

Turklāt tika pierādīts, ka transplantētās neokorteksa un muguras smadzeņu embrionālo rudimentu neiroepitēlija šūnas 1-2 mēnešu laikā pēc transplantācijas nobriedušu žurku bojātajā sēžas nervā izdzīvo un diferencējas par neiroblastiem, jauniem un nobriedušiem neironiem. Pētot žurku neokorteksa un muguras smadzeņu embrionālo rudimentu NADPH-pozitīvo neironu attīstības dinamiku heterotopiskos allotransplantātos (15 dienu žurku embrijs), recipientu žurku sēžas nervu gareniskajos griezumos tika atklāta 70 līdz 80% neirotransplantātu iesakņošanās, kas bija atkarīga no novērošanas perioda. Nedēļu pēc operācijas transplantātos sāka veidoties uni- un bipolāri neiroblasti ar noapaļotiem gaišiem kodoliem un vienu vai diviem kodoliem, kam pievienojās klasteru veidošanās. Autoriem neizdevās starp neiroblastiem noteikt šūnas, kas satur NADPH diaforāzi (NADPH-d). Pēc 7 dienām tikai asinsvadu šūnu elementi bija NADPH pozitīvi - kapilāru endotēlija šūnas transplantāta biezumā, kā arī recipienta sēžas nerva asinsvadu endotēlija un gludo muskuļu šūnas. Tā kā asinsvadu gludo muskuļu šūnās NO sintāzes (NOS) indukcija notiek IL-1 ietekmē, autori NADPH pozitīvu gludo muskuļu šūnu parādīšanos sēžas nerva asinsvados saista ar IL-1 klātbūtni, kas sintezēts bojātajos nervu stumbros. Ir zināms, ka neiroģenēze embrionālo smadzeņu rudimentu transplantācijas apstākļos notiek sinhroni ar neironu attīstību in situ. Morfoloģisko pētījumu rezultāti liecina, ka dažu transplantātu neironu elementu diferenciācija septiņas dienas pēc transplantācijas atbilst šūnu diferenciācijai līdzīgās jaundzimušo žurku smadzeņu daļās. Tādējādi heterotopiskas transplantācijas apstākļos perifērajā nervā transplantētās embrionālās nervu šūnas uzrāda spēju sintezēt NADPH-d. Šajā gadījumā muguras smadzeņu transplantātos ir atrodams vairāk neironu, kas satur NADPH-d, nekā neokorteksa transplantātos, bet slāpekļa oksīda sintēze transplantētajos neironos sākas vēlāk nekā in situ attīstības laikā. Mugurkaulnieku CNS NOS-pozitīvas šūnas parādās jau pirmsdzemdību periodā. Tiek uzskatīts, ka NO veicina sinaptisko savienojumu veidošanos attīstošajās smadzenēs, un NOS-pozitīvu nervu aferentu šķiedru klātbūtne, kas nodrošina NO sintēzi smadzenīšu neiroblastos, stimulē neironu migrāciju un diferenciāciju, kā rezultātā veidojas normāla smadzeņu citoarhitektūra. Ir konstatēta svarīga NO loma sinapsoģenēzē tektumā - tikai tie neironi, kuriem bija sinaptiski savienojumi ar tīklenes šūnām, izrādījās NOS-pozitīvi.

Ir zināms, ka slāpekļa oksīds ir viens no smadzeņu aktivitātes regulatoriem, kur tas veidojas no arginīna NO sintāzes ietekmē, kurai piemīt diaforāzes aktivitāte. Centrālajā nervu sistēmā NO tiek sintezēts asinsvadu endotēlija šūnās, mikroglijā, astrocītos un dažādu smadzeņu daļu neironos. Pēc traumatiskas smadzeņu traumas, kā arī hipoksijas un išēmijas laikā tiek novērots neironu skaita pieaugums, kas satur NO, kas ir viens no smadzeņu asinsrites regulatoriem. Ņemot vērā NO spēju inducēt sinapsoģenēzi, īpaši interesanti ir pētīt NO saturošu šūnu veidošanos neirotransplantācijas apstākļos uz recipienta nervu audu traumatisku bojājumu fona.

Ne mazāk svarīgs ir neirotransplantācijas ietekmes pētījums uz nosacītā refleksa uzvedības stereotipu. Eksperimentos, kuros pētīta embrionālā lokusa coeruleus audu intracerebrālas un attālas (starp CII un CIII) transplantācijas (17–19 grūtniecības dienas) ietekme uz atmiņas procesiem un kateholamīnu saturu žurkām ar frontotemporālā neokorteksa iznīcināšanu, tika pierādīts, ka smadzeņu frontotemporālā garozas elektrolītiskie bojājumi izjauc nosacītā refleksa emocionālās izvairīšanās (atmiņas) reakcijas stereotipu, vājina fizioloģisko aktivitāti, samazina norepinefrīna saturu koagulētā neokorteksa zonā, bet palielina tā līmeni hipotalāmā, kur novērojama adrenalīna koncentrācijas samazināšanās, lai gan tā daudzums asinīs un virsnieru dziedzeros palielinās.

Embrionālā lokusa coeruleus audu intracerebrālas transplantācijas rezultātā 81,4% dzīvnieku atjaunojas kondicionētās refleksās emocionālās izvairīšanās reakcijas stereotips, ko izjauc smadzeņu garozas frontotemporālo reģionu elektrolītiskie bojājumi, normalizējas adrenalīna saturs vidussmadzeņu, hipotalāma un neokorteksa retikulārajā formācijā, un tā līmenis hipokampā pat palielinās, kas apvienojumā ar adrenalīna koncentrācijas samazināšanos asinīs.

Embrionālā locus coeruleus audu attālināta transplantācija ne tikai atjauno traucēto kondicionētās refleksās emocionālās izvairīšanās reakcijas stereotipu žurkām ar frontotemporālās garozas elektrolītiskiem bojājumiem, bet arī palielina norepinefrīna un adrenalīna saturu, galvenokārt hipotalāmā, asinīs, virsnieru dziedzeros un sirdī. Tiek pieņemts, ka tas ir saistīts ar transplantāta vaskularizāciju, neirotransmiteru iekļūšanu asinsritē, to pāreju caur hematoencefālisko barjeru un adrenalīna un norepinefrīna atpakaļsaistes mehānismu aktivizēšanu pēc uzņemšanas veidiem 1, 2, 3. Autori uzskata, ka norepinefrīna līmeņa ilgstošu stabilizāciju transplantāta iesakņošanās un funkcionēšanas apstākļos var uzskatīt par tā pakāpeniskas izdalīšanās minimālās devās no locus coeruleus neironiem fenomenu.

Embrionālo nervu audu transplantācijas pozitīvā klīniskā ietekme var būt saistīta arī ar pēdējo spēju ietekmēt asinsvadu neoplazmas procesus, kuru regulēšanā tieši piedalās augšanas faktori un citokīni. Vaskulogenēzi aktivizē angiogēnie augšanas faktori - asinsvadu endotēlija augšanas faktors (VEGF), FGF, PDGF un TGF, kas tiek sintezēti išēmijas laikā, kas darbojas kā angioģenēzes ierosināšanas moments. Ir pierādīts, ka asinsvadu augšanas potenciāla samazināšanās notiek organisma novecošanās procesā, kam ir nozīmīga loma tādu slimību kā koronārā sirds slimība un apakšējo ekstremitāšu obliterējošā ateroskleroze patoģenēzē. Audu išēmija attīstās arī daudzu citu slimību gadījumā. Angiogēno faktoru ievadīšana išēmiskajās zonās (terapeitiskā angioģenēze) stimulē asinsvadu augšanu išēmiskajos audos un uzlabo mikrocirkulāciju, pateicoties kolaterālās asinsrites attīstībai, kas savukārt palielina skartā orgāna funkcionālo aktivitāti.

VEGF un FGF tiek uzskatīti par daudzsološākajiem klīniskai lietošanai. Pirmo randomizēto pētījumu rezultāti bija iepriecinoši, īpaši, ja angiogēno faktoru optimālās devas un ievadīšanas metodes tika izvēlētas pareizi. Šajā sakarā tika veikts eksperimentāls no cilvēka embrija smadzeņu audiem izolēta ekstrakta angiogēnās aktivitātes novērtējums. Darbā tika izmantots abortēts materiāls, kas iegūts divdesmitajā grūtniecības nedēļā un apstrādāts saskaņā ar I. Maciog et al. (1979) metodi, ko modificēja IC ANRF. Šīs zāles ir "Endoteliālo šūnu augšanas papildinājuma" ("Sigma") analogs un ir dabisks cilvēka angiogēno faktoru maisījums, kas ietver VEGF un FGF. Eksperimenti tika veikti ar žurkām, izmantojot pakaļkāju un miokarda audu išēmijas modeļus. Pamatojoties uz sārmainās fosfatāzes aktivitātes pētījumu eksperimentāliem dzīvniekiem, kuriem tika ievadīts embrija nervu audu ekstrakts, tika konstatēts kapilāru skaita pieaugums uz miokarda laukuma vienību - gan sirds gareniskajā, gan šķērsgriezumā. Preparāta angiogēnā aktivitāte izpaudās, tieši ievadot išēmiskajā zonā, kā arī sistēmiskas (intramuskulāras) ievadīšanas gadījumā, kas noveda pie pēcinfarkta rētas vidējā laukuma samazināšanās.

Jebkurā embrionālā nervu audu transplantācijas variantā ir ārkārtīgi svarīgi pareizi izvēlēties transplantējamā embrionālā materiāla gestācijas vecumu. Salīdzinošā analīze par šūnu preparātu efektivitāti no 8, 14 un 16-17 dienu vecu žurku embriju embrionālā ventrālā mezencephalona trīs mēnešus pēc intrastriatālas neirotransplantācijas pieaugušām žurkām ar parkinsonismu automatizētā apomorfīna izraisītas motorās asimetrijas testā atklāja ievērojami augstāku CNS šūnu preparātu efektivitāti no 8 dienu embrijiem un zemāko efektivitāti no 16-17 dienu veciem embrionāliem nervu audiem. Iegūtie dati korelēja ar histomorfoloģiskās analīzes rezultātiem, jo īpaši ar transplantātu lielumu, gliālās reakcijas smagumu un dopamīnerģisko neironu skaitu tajos.

Embrionālo nervu audu šūnu terapeitiskās iedarbības atšķirības var būt saistītas gan ar pašu šūnu nenobrieduma pakāpi un apņemšanos, gan ar to atšķirīgo reakciju uz augšanas faktoriem, kas izdalās dopamīnerģisko neironu inducēto bojājumu zonā. Jo īpaši EGF un FGF2 ietekme uz telencephalālo neironu cilmes šūnu attīstību in vivo notiek dažādos embriogenēzes posmos. 8,5 dienas vecu peļu embriju neiroepitēlija šūnas, kultivējot in vitro seruma nesaturošā vidē, proliferējas FGF2 klātbūtnē, bet ne EGF, uz kuru reaģē tikai cilmes šūnu populācijas, kas izolētas no embriju smadzenēm vēlākās attīstības stadijās. Tajā pašā laikā neironu cilmes šūnas proliferējas, reaģējot uz katru no šiem mitogēniem, un papildus veicina augšanu, ja kultūrai ar zemu šūnu sēšanas blīvumu pievieno EGF un FGF2. EGF-reaktīvās neironu cilmes šūnas no 14,5 dienas vecu peļu embriju germinālajām zonām tiek uzskatītas par FGF-reaktīvo neironu cilmes šūnu lineāriem pēctečiem, kas pirmo reizi parādās pēc 8,5 grūtniecības dienām. Neirālo cilmes šūnu un cilmes šūnu potenciālais fenotips ir atkarīgs no to mikrovides sarežģītās ietekmes. Neirālo šūnu imūnfenotipa noteikšana no 8-12 un 17-20 nedēļas vecu cilvēka embriju periventrikulārajām un hipokampālajām zonām, izmantojot plūsmas citofluorometriju, atklāja būtisku mainīgumu, kas saistīts gan ar gestācijas vecumu, gan ar donora biomateriāla individuālajām konstitucionālajām iezīmēm. Kad šīs neironu cilmes šūnas tiek kultivētas selektīvā seruma nesaturošā vidē ar EGF, FGF2 un NGF, neirosfēras veidojas ar ātrumu, kas ir būtiski atkarīgs no gestācijas vecuma. Šūnas no 5-13 nedēļas vecu cilvēka embriju dažādām smadzeņu daļām, īslaicīgi kultivējot ar FGF2 monoslāņa kultūrā uz laminīna substrāta augšanas faktoru niecīgā daudzumā, 6 nedēļas saglabā proliferāciju ar augstu nestīna pozitīvu šūnu procentuālo daudzumu uz šūnu spontānas veidošanās fona ar visu trīs neironu diferenciācijas līniju marķieriem. Šūnas, kas izolētas no cilvēka embrija mezencephalona gestācijas periodā, kas pārsniedz 13 nedēļas, proliferējas EGF ietekmē un arī veido neirosfēras. Izmantojot EGF un FGF2 kombināciju, tika panākts sinerģisks efekts. Visintensīvākā neironu cilmes šūnu proliferācija ar neirosfēru veidošanos tiek novērota, kultivējot 6-8 nedēļas vecu cilvēka embriju smadzeņu garozas audus EGF2, IGF1 un 5% zirgu seruma klātbūtnē uz substrāta ar fibronektīnu.

Jāatzīmē, ka jautājumi par gestācijas vecumu un embrionālās CNS šķērsgriezumu, kura audus vēlams izmantot neirotransplantācijas vajadzībām, joprojām paliek atklāti. Atbildes uz tiem jāmeklē attīstošo smadzeņu neiroģenēzē, kas turpinās visā pirmsdzemdību periodā - laikā, kad neironālās caurules epitēlijs veido daudzslāņu struktūru. Tiek uzskatīts, ka cilmes šūnu un jauno neironu avots ir radiālā glija, kas sastāv no iegarenām šūnām ar gariem izaugumiem, kas radiāli vērsti attiecībā pret smadzeņu pūslīšu sieniņu un saskaras ar kambaru iekšējo virsmu un smadzeņu sienas ārējo pialu. Iepriekš radiālajai glijai bija tikai neironu trakta funkcija, pa kuru neiroblasti migrē no ventrālā apgabala uz virspusējām daļām, un tai tika piešķirta arī skeleta loma pareizas garozas laminārās organizācijas veidošanās procesā. Mūsdienās ir noskaidrots, ka, attīstībai turpinoties, radiālā glija transdiferencējas astrocītos. Ievērojama tā daļa zīdītājiem samazinās tūlīt pēc piedzimšanas, tomēr tām dzīvnieku sugām, kurās radiālā glija tiek saglabāta līdz pieauguša cilvēka vecumam, neiroģenēze aktīvi notiek pēcdzemdību periodā.

Kultūrā grauzēju embrionālā neokorteksa radiālās gliālās šūnas veidoja neironus un gliālās šūnas, neironiem galvenokārt veidojoties 14. līdz 16. gestācijas dienu embrija attīstības vecumā (peļu un žurku smadzeņu garozas neiroģenēzes maksimālās intensitātes periods). 18. embriogenēzes dienā diferenciācija virzījās uz astrocītu veidošanos, ievērojami samazinoties jaunizveidoto neironu skaitam. Radiālo gliālo šūnu marķēšana in situ ar GFP ļāva noteikt asimetrisku iezīmēto šūnu dalīšanos 15 līdz 16 dienas vecu žurku embriju smadzeņu pūslīšu dobumā, parādoties meitas šūnām ar neiroblastu imunoloģiskām un elektrofizioloģiskām īpašībām. Jāatzīmē, ka saskaņā ar dinamisko novērojumu rezultātiem jaunie neiroblasti migrācijai uz piāla virsmu izmanto radiālo gliālo šūnu mātes šūnas.

Radiālās glijas endogēnais marķieris ir starpfilamenta proteīns nestīns. Izmantojot šūnu, kas iezīmētas ar ar GFP saistītu retrovīrusu un ekspresētas nestīna kontrolē, fluorescences plūsmas šķirošanas metodi, tika pierādīts, ka cilvēka hipokampa zobu girusa un hilusa cilmes šūnas (materiāls iegūts epilepsijas operāciju laikā) ekspresē nestīnu. Tāpēc tās pieder pie radiālās glijas, kas cilvēkiem, tāpat kā citiem zīdītājiem, saglabājas tikai zobu girusā.

Vienlaikus šūnu transplantācijas efektivitāti nosaka ne tikai donoru šūnu augstā dzīvotspēja, to diferenciācijas potenciāls un spēja aizstāt bojātās šūnas, bet, pirmkārt, to virzītā migrācija. Transplantēto šūnu pilnīga funkcionālā integrācija ir atkarīga no to migrācijas spējas - neizjaucot recipienta smadzeņu citoarhitektūru. Tā kā radiālā glija pēcdzemdību periodā piedzīvo gandrīz pilnīgu reducēšanos, bija jānoskaidro, kā donoru šūnas var pārvietoties no transplantācijas zonas uz smadzeņu bojājuma vietu pieaugušiem recipientiem. Pastāv divi šūnu migrācijas uz CNS varianti, kas nav atkarīgi no radiālās glijas: tangenciālās migrācijas fenomens jeb neiroblastu pārvietošanās smadzeņu garozas attīstības laikā perpendikulāri radiālās glijas tīklam, kā arī migrācija "rindā" vai "pa ķēdi". Jo īpaši neironu cilmes šūnu migrācija no rostrālās subventrikulārās zonas uz ožas sīpolu notiek kā cieši blakus esošu šūnu secība, ko ieskauj glijas šūnas. Tiek uzskatīts, ka šīs šūnas kā migrācijas substrātu izmanto partneršūnas, un šādas starpšūnu mijiedarbības galvenais regulators ir PSA-NCAM (polisializēta neironu šūnu adhēzijas molekula). Tādēļ neironu migrācijai nav obligāti nepieciešama radiālo gliju vai jau esošo aksonu savienojumu līdzdalība. Šūnu kustības ekstraradiālā forma "virknē" gar rostrālo migrācijas traktu tiek saglabāta visu mūžu, kas norāda uz reālu transplantētu neironu cilmes šūnu mērķtiecīgas piegādes iespēju nobriedušai nervu sistēmai.

Pastāv hipotēze par cilmes šūnu līnijas klātbūtni smadzeņu ontoģenēzē, saskaņā ar kuru smadzeņu attīstības sākumposmā cilmes šūna ir neiroepitēlija šūna, kas, nobriestot, transdiferencējas radiālajās glijās. Pieaugušā vecumā cilmes šūnu lomu pilda šūnas, kurām piemīt astrocītu īpašības. Neskatoties uz vairākiem pretrunīgiem punktiem (pretrunas par hipokampa cilmes šūnām, kā arī dziļajām smadzeņu daļām, kurām nav slāņainas garozas un kuras attīstās no talāma tuberkuliem, kur radiālās glijas nav), skaidrs un vienkāršs priekšstats par konsekventām cilmes šūnu fenotipa izmaiņām visā ontoģenēzes gaitā izskatās ļoti pievilcīgs.

Mikrovides faktoru ietekme uz neironu diferenciācijas šūnu noteikšanu un sekojošo diferenciāciju ir skaidri pierādīta, transplantējot nobriedušas žurkas muguras smadzeņu cilmes šūnas dažādos nobriedušas nervu sistēmas reģionos. Kad cilmes šūnas tika transplantētas zobu girusā vai neironu migrācijas reģionā ožas sīpolos, tika novērota transplantēto šūnu aktīva migrācija, veidojoties daudziem neironiem. Cilmes šūnu transplantācija muguras smadzenēs un Amona raga reģionā izraisīja astrocītu un oligodendrocītu veidošanos, savukārt transplantācija zobu girusā izraisīja ne tikai gliālo šūnu, bet arī neironu veidošanos.

Pieaugušai žurkai dalošo šūnu skaits zobu girusā var sasniegt vairākus tūkstošus dienā - mazāk nekā 1% no kopējā granulāro šūnu skaita. Neironi veido 50-90% šūnu, astocīti un citi glijas elementi - aptuveni 15%. Atlikušajām šūnām nepiemīt neironu un glijas antigēniskās īpašības, bet tās satur endotēlija šūnu antigēnus, kas norāda uz ciešu saistību starp neiroģenēzi un angioģenēzi zobu girusā. Endotēlija šūnu diferenciācijas par neironu prekursoršūnām iespējas atbalstītāji atsaucas uz endotēlija šūnu spēju in vitro sintezēt BDNF.

Neironu ķēžu pašsalikšanās ātrums ir iespaidīgs: diferenciācijas laikā granulāro šūnu priekšteču šūnas migrē uz zobaino vijumu un veido izaugumus, kas aug Amona raga SAZ zonas virzienā un veido sinapses ar piramīdveida glutamāterģiskiem un starpkalāriem inhibējošiem neironiem. Jaunizveidotās granulārās šūnas 2 nedēļu laikā integrējas esošajās neironu ķēdēs, un pirmās sinapses parādās jau 4–6 dienas pēc jaunu šūnu parādīšanās. Bieži ievadot BrdU vai 3H-timidīnu (viena no pieaugušo cilmes šūnu identificēšanas metodēm) nobriedušiem dzīvniekiem, Amona ragā tika atrasts liels skaits iezīmētu neironu un astrocītu, kas norāda uz jaunu neironu veidošanās iespēju ne tikai zobainajā vijumā, bet arī citās hipokampa daļās. Interese par dalīšanās, diferenciācijas un šūnu nāves procesiem nobriedušu smadzeņu hipokampa zobainajā vijumā ir saistīta arī ar to, ka šeit veidotie neironi ir lokalizēti vienā no hipokampa galvenajām zonām, kas atbild par mācīšanās un atmiņas procesiem.

Tādējādi mūsdienās ir noskaidrots, ka neironu cilmes šūnas rodas nobriedušu grauzēju laterālā kambara subependimālās zonas šūnām. Tās migrē pa rostrālo migrācijas traktu, ko veido gareniski orientētas astrogliālās šūnas, uz ožas sīpolu, kur tās iestrādājas granulāro šūnu slānī un diferencējas par šīs struktūras neironiem. Pieaugušu pērtiķu rostrālajā migrācijas traktā ir konstatēta neironu cilmes šūnu migrācija, kas norāda uz jaunu neironu veidošanās iespēju primātu ožas sīpolā. No pieauguša cilvēka ožas sīpola ir izolētas neironu cilmes šūnas un pārvietotas līnijās, kuru klonētās šūnas diferencējas par neironiem, astrocītiem un oligodendrocītiem. Cilmes šūnas ir atrastas žurku, peļu, pērtiķu un cilvēku nobriedušu smadzeņu hipokampā. Zobainās fascijas subgranulārās zonas neironu cilmes šūnas ir cilmes šūnu avots, kas migrē uz hipokampa mediālajām un laterālajām ekstremitātēm, kur tās diferencējas par nobriedušām granulārajām šūnām un gliālajiem elementiem. De novo izveidojušos zobainās fascijas neironu aksoni ir izsekojami līdz CA3 laukam, kas norāda uz jaunizveidoto neironu līdzdalību hipokampa funkciju īstenošanā. Pieaugušu pērtiķu neokorteksa asociācijas zonās tika atrastas neironu cilmes šūnas, kas migrē no subventrikulārās zonas. Peles smadzeņu neokorteksa VI slānī jauni piramīdveida neironi tiek atklāti 2–28 nedēļas pēc šī slāņa dabisko neironu izraisītiem bojājumiem un nāves iepriekš snaudošo subventrikulārās zonas cilmes šūnu migrācijas dēļ. Visbeidzot, pēcdzemdību neiroģenēzes realitāti cilvēka smadzenēs apliecina divkāršs kortikālo neironu skaita pieaugums, kas turpinās pirmos 6 gadus pēc dzimšanas.

Praktiskajā šūnu transplantoloģijā ne mazsvarīga nozīme ir neironu cilmes šūnu un cilmes šūnu reprodukcijas un diferenciācijas procesu regulēšanas jautājumam. Vissvarīgākie faktori, kas nomāc neironu cilmes šūnu proliferāciju, ir glikokortikoīdi, kas strauji samazina dalīšanās skaitu, savukārt virsnieru dziedzeru izņemšana, gluži pretēji, ievērojami palielina mitožu skaitu (Gould, 1996). Jāatzīmē, ka grauzējiem zobu girusa morfoģenēze ir visintensīvākā pirmajās divās pēcdzemdību attīstības nedēļās stresa reakcijas neesamības periodā, uz fona, kad strauji samazinās virsnieru garozas steroīdo hormonu ražošana un sekrēcija. Kortikosteroīdi kavē granulāro šūnu migrāciju - jaunie neironi netiek iestrādāti zobu girusa granulārajā slānī, bet paliek hilusā. Tiek pieņemts, ka vienlaikus tiek traucēti sinaptisko savienojumu veidošanās procesi. Šūnu aizsardzība no šādas "steroīdu agresijas" tiek veikta ar minimālu mineralokortikoīdu un glikokortikoīdu receptoru ekspresiju uz proliferējošām granulārajām šūnām ne tikai zobu girusa attīstības laikā, bet arī nobriedušiem dzīvniekiem. Tomēr no visiem smadzeņu neironiem tieši hipokampa neironiem raksturīgs visaugstākais glikokortikoīdu receptoru saturs, kas izraisa stresa ietekmi uz hipokampu. Psihoemocionālais stress un stresa situācijas kavē neiroģenēzi, un hronisks stress strauji samazina dzīvnieku spēju apgūt jaunas prasmes un mācīties. Izteiktāka hroniska stresa negatīvā ietekme uz neiroģenēzi ir diezgan saprotama, ja ņemam vērā neironu cilmes šūnu pārsvarā snaudošo stāvokli. Imobilizējot grūsnas žurkas (grauzējiem - ārkārtīgi spēcīgs stresa faktors), tika konstatēts, ka pirmsdzemdību stress izraisa arī šūnu skaita samazināšanos dentatālajā girusā un ievērojami kavē neiroģenēzi. Ir zināms, ka glikokortikoīdi piedalās depresīvu stāvokļu patogenezē, kuru morfoloģiskais ekvivalents ir neiroģenēzes inhibīcija, neironu un starpneironu savienojumu patoloģiska reorganizācija un nervu šūnu nāve. Savukārt antidepresanti ķīmijterapijas līdzekļi aktivizē neironu veidošanos de novo, kas apstiprina saistību starp jaunu neironu veidošanās procesiem hipokampā un depresijas attīstību. Estrogēniem ir būtiska ietekme uz neiroģenēzi, kuras iedarbība ir pretēja glikokortikosteroīdu iedarbībai un sastāv no neironu cilmes šūnu proliferācijas un dzīvotspējas atbalstīšanas. Jāatzīmē, ka estrogēni ievērojami palielina dzīvnieku mācīšanās spējas. Daži autori saista granulāro šūnu skaita cikliskās izmaiņas un to pārmērīgo skaitu mātītēm ar estrogēnu ietekmi.

Ir zināms, ka neiroģenēzi kontrolē EGF, FGF un BDNF, tomēr ārējo signālu ietekmes mehānismi uz cilmes šūnām no mitogēniem un augšanas faktoriem nav pietiekami pētīti. Ir noskaidrots, ka PDGF in vitro uztur cilmes šūnu diferenciācijas neironu virzienu, un ciliārais neirotrofiskais faktors (CNTF), tāpat kā trijodtironīns, stimulē galvenokārt gliālo elementu - astrocītu un oligodendrocītu - veidošanos. Hipofīzes adenilātciklāzi aktivējošais proteīns (PACAP) un vazoaktīvais zarnu peptīds (VIP) aktivizē neironu cilmes šūnu proliferāciju, bet vienlaikus kavē meitas šūnu diferenciācijas procesus. Opioīdi, īpaši ilgstošas iedarbības gadījumā, būtiski kavē neiroģenēzi. Tomēr opioīdu receptori nav identificēti cilmes šūnās un zobu girusa neironu cilmes šūnās (tie atrodas diferencējošos embrionālā perioda neironos), kas neļauj novērtēt opioīdu tiešo iedarbību.

Praktiskās reģeneratīvi plastiskās medicīnas vajadzības ir piespiedušas pētniekus pievērst īpašu uzmanību cilmes šūnu pluri- un multipotences izpētei. Šo īpašību ieviešana pieauguša organisma reģionālo cilmes šūnu līmenī nākotnē varētu nodrošināt nepieciešamā transplantācijas materiāla ražošanu. Iepriekš tika parādīts, ka neirālo cilmes šūnu epigenetiskā stimulācija ļauj iegūt proliferējošas šūnas, kas jau ir iepriekš izveidotas atbilstoši neirālajiem fenotipiem, kas ierobežo to skaitu. Izmantojot embrionālo cilmes šūnu totipotentās īpašības, proliferācija, līdz tiek iegūts pietiekams šūnu skaits, notiek agrāk nekā neirālā diferenciācija, un pavairotās šūnas viegli pārveidojas par neirālo fenotipu. Lai iegūtu neirālās cilmes šūnas, ESŠ tiek izolētas no blastocistas iekšējās šūnu masas un kultivētas obligātā LIF klātbūtnē, kas saglabā to totipotenci un spēju neierobežoti dalīties. Pēc tam, izmantojot retīnskābi, tiek inducēta ESŠ neirālā diferenciācija. Iegūto neirālo cilmes šūnu transplantācija striatumā, ko bojā hinolīns un 6-hidroksidopamīns, notiek ar to diferenciāciju dopamīnerģiskos un serotonīnerģiskos neironos. Pēc injekcijas žurkas embrija smadzeņu kambaros no ESŠ iegūtās neironu cilmes šūnas migrē uz dažādiem recipienta smadzeņu reģioniem, tostarp garozu, striatumu, starpsienu, talāmu, hipotalāmu un smadzenītēm. Šūnas, kas paliek sirds kambaru dobumā, veido epitēlija struktūras, kas atgādina neironu caurulīti, kā arī atsevišķas neirālo audu saliņas. Recipienta embrija smadzeņu parenhīmā transplantētās šūnas ražo trīs galvenos nervu sistēmas šūnu tipus. Dažām no tām ir pagarināti apikālie dendrīti, piramīdveida šūnu ķermeņi un bazālie aksoni, kas izvirzās smadzeņu lielgabalā. Donora izcelsmes astrocīti pagarina izaugumus uz tuvumā esošajiem kapilāriem, un oligodendrocīti cieši saskaras ar mielīna uzmavām, piedaloties mielīna veidošanā. Tādējādi no ESŠ in vitro iegūtās neironu cilmes šūnas spēj veikt virzītu migrāciju un reģionālu diferenciāciju, kas ir adekvāta mikrovides signāliem, nodrošinot daudzas attīstošos smadzeņu zonas ar neironiem un glijām.

Daži autori apsver pieauguša organisma reģionālo cilmes šūnu de- un transdiferenciācijas iespēju. Netiešu šūnu dediferenciācijas apstiprinājumu kultūrā ar to potenciāla paplašināšanos sniedz dati par peļu neironu cilmes šūnu iesakņošanos sarkanajās kaulu smadzenēs ar sekojošu šūnu līniju attīstību no tām, iegūstot funkcionāli aktīvas perifēro asiņu šūnas. Turklāt ģenētiski iezīmētu (LacZ) neirosfēras šūnu, kas iegūtas no nobriedušām vai embrionālām smadzenēm, transplantācija apstarotu peļu ar nomāktu hematopoēzi smadzenēs izraisīja ne tikai neironu atvasinājumu veidošanos no cilmes šūnām, bet arī asins šūnu veidošanos, kas norāda uz neironu cilmes šūnu pluripotenci, kas realizēta ārpus smadzenēm. Tādējādi neironu cilmes šūna spēj diferencēties asins šūnās signālu ietekmē no kaulu smadzeņu mikrovides ar iepriekšēju transformāciju hematopoētiskajā cilmes šūnā. No otras puses, transplantējot kaulu smadzeņu hematopoētiskās cilmes šūnas smadzenēs, tika konstatēta to diferenciācija smadzeņu audu mikrovides ietekmē gliju un neironu šūnās. Līdz ar to neironu un hematopoētisko cilmes šūnu diferenciācijas potenciālu neierobežo audu specifika. Citiem vārdiem sakot, lokālās mikrovides faktori, kas atšķiras no smadzeņu un kaulu smadzeņu audiem raksturīgajiem faktoriem, spēj mainīt šo šūnu diferenciācijas virzienu. Tika pierādīts, ka neironu cilmes šūnas, ievadītas apstarotu peļu venozajā sistēmā, rada mieloīdu, limfoīdu un nenobriedušu hematopoētisko šūnu populācijas liesā un kaulu smadzenēs. In vitro tika noteikta kaulu smadzeņu morfogēnisko proteīnu (BMP) ietekme uz neironu cilmes šūnu izdzīvošanu un diferenciāciju, nosakot, tāpat kā embrioģenēzes sākumposmā, to attīstību neironu vai gliju virzienā. Neirālo cilmes šūnu kultūrās no 16 dienas veciem žurku embrijiem BMP inducē neironu un astrogliju veidošanos, savukārt no perinatālām smadzenēm iegūtās cilmes šūnu kultūrās veidojas tikai astrocīti. Turklāt BMP nomāc oligodendrocītu veidošanos, kas in vitro parādās tikai pievienojot BMP antagonistu noggīnu.

Transdiferenciācijas procesi nav specifiski sugai: cilvēka kaulu smadzeņu hematopoētiskās cilmes šūnas, kas transplantētas nobriedušu žurku striatumā, migrē uz ārējās kapsulas balto vielu, ipsi- un kontralaterālo neokorteksu, kur tās veido astrocītiem līdzīgus šūnu elementus (Azizi et al., 1998). Kad kaulu smadzeņu cilmes šūnas tiek allotransplantētas jaundzimušu peļu laterālajā kambarī, hematopoētisko cilmes šūnu migrāciju var izsekot līdz priekšsmadzeņu un smadzenīšu struktūrām. Hipokampa striatumā un molekulārajā slānī migrētās šūnas tiek pārveidotas par astrocītiem, un ožas sīpolā, smadzenīšu iekšējā granulāro šūnu slānī un smadzeņu stumbra retikulārajā formācijā tās veido neironiem līdzīgas šūnas ar pozitīvu reakciju uz neirofilamentiem. Pēc hematopoētisko šūnu intravenozas ievadīšanas pieaugušām pelēm GFP iezīmēti mikro- un astrocīti tika atklāti neokorteksā, talāmā, smadzeņu stumbrā un smadzenītēs.

Turklāt kaulu smadzeņu mezenhimālās cilmes šūnas, kas rada visu veidu saistaudu šūnas, noteiktos apstākļos var arī pakļauties neironu transdiferenciācijai (atgādiniet, ka mezenhīma embrionālais avots ir neironu cekulu šūnas). Ir pierādīts, ka cilvēka un peles kaulu smadzeņu stromas šūnas, kas kultivētas in vitro EGF vai BDNF klātbūtnē, ekspresē neironu cilmes šūnu nestīna marķieri, un dažādu augšanas faktoru kombināciju pievienošana noved pie šūnu veidošanās ar glijas (GFAP) un neironu (kodola proteīna, NeuN) marķieriem. Marķētas singenētiskas mezenhimālās cilmes šūnas, kas transplantētas jaundzimušo peļu smadzeņu laterālajā kambarī, migrē un lokalizējas priekšsmadzenēs un smadzenītēs, neizjaucot recipienta smadzeņu citoarhitektūru. Kaulu smadzeņu mezenhimālās cilmes šūnas diferencējas par nobriedušiem astrocītiem hipokampa striatumā un molekulārajā slānī, un apdzīvo ožas sīpolu, smadzenīšu granulāros slāņus un retikulāro formāciju, kur tās transformējas par neironiem. Cilvēka kaulu smadzeņu mezenhimālās cilmes šūnas spēj in vitro diferencēties par makrogliju un pēc transplantācijas integrēties žurku smadzeņu struktūrās. Tieša kaulu smadzeņu mezenhimālo cilmes šūnu transplantācija pieaugušu žurku hipokampā ir saistīta arī ar to migrāciju smadzeņu parenhīmā un neirogliālu diferenciāciju.

Tiek pieņemts, ka kaulu smadzeņu cilmes šūnu transplantācija varētu paplašināt šūnu terapijas iespējas CNS slimību ārstēšanā, kurām raksturīga pārmērīga neironu patoloģiska nāve. Tomēr jāatzīmē, ka ne visi pētnieki atzīst neironu un hematopoētisko cilmes šūnu savstarpējas transformācijas faktu, īpaši in vivo, kas atkal ir saistīts ar uzticama marķiera trūkumu to transdiferenciācijas un tālākās attīstības novērtēšanai.

Cilmes šūnu transplantācija paver jaunus apvāršņus iedzimtas neiroloģiskas patoloģijas šūnu gēnu terapijai. Neirālo cilmes šūnu ģenētiskā modifikācija ietver ģenētiski regulējošu konstrukciju ievietošanu, kuru produkti automātiskās regulācijas režīmā mijiedarbojas ar šūnu cikla olbaltumvielām. Šādu gēnu transdukcija embrionālajās cilmes šūnās tiek izmantota, lai pavairotu neironu cilmes šūnas. Lielākā daļa ģenētiski modificētu šūnu klonu uzvedas kā stabilas šūnu līnijas, neuzrādot transformācijas pazīmes in vivo vai in vitro, bet tiem piemīt izteikta spēja kontakta inhibīcijā pret proliferāciju. Transplantācijas laikā pavairotās transfektētās šūnas tiek integrētas recipienta audos, neizjaucot citoarhitektūru un neveicot audzēja transformāciju. Donora neironu cilmes šūnas nedeformē integrācijas zonu un vienlīdzīgi konkurē par vietu ar saimnieka cilmes šūnām. Tomēr 2.-3. dienā transfektantu šūnu dalīšanās intensitāte strauji samazinās, kas atbilst to proliferācijas kontakta inhibīcijai in vitro. Neirālā cilmes transfektantu embrijiem-recipientiem nav centrālās nervu sistēmas attīstības anomāliju, visas smadzeņu zonas, kas saskaras ar transplantātu, attīstās normāli. Pēc transplantācijas neironu cilmes šūnu kloni ātri migrē no injekcijas zonas un bieži vien pārsniedz atbilstošās embrionālās zonas gar rostrālo traktu, pienācīgi integrējoties ar citām smadzeņu daļām. Ģenētiski modificētu neironu cilmes šūnu klonu un transfektētu šūnu līniju integrācija saimniekorganisma smadzenēs ir raksturīga ne tikai embrionālajam periodam: šīs šūnas tiek implantētas daudzās augļa, jaundzimušā, pieaugušā un pat novecojoša recipienta organisma centrālās nervu sistēmas daļās un demonstrē spēju atbilstoši integrēties un diferencēties. Jo īpaši pēc transplantācijas smadzeņu kambara dobumā transfektētās šūnas migrē, nebojājot hematoencefālisko barjeru, un kļūst par neatņemamām smadzeņu audu funkcionālām šūnu sastāvdaļām. Donora neironi veido atbilstošas sinapses un ekspresē specifiskus jonu kanālus. Saglabājot hematoencefāliskā barjeras integritāti, astroglija, transfektantu neironu cilmes šūnu atvasinājums, pagarina izaugumus līdz smadzeņu asinsvadiem, un no donora iegūtie oligodendrocīti ekspresē mielīna bāzes proteīnu un mielinizētus neironu izaugumus.

Turklāt neironu cilmes šūnas tiek transfektētas, lai tās izmantotu kā šūnu vektorus. Šādas vektorģenētiskas konstrukcijas nodrošina nervu sistēmas attīstībā iesaistīto svešo gēnu stabilu ekspresiju in vivo vai tiek izmantotas esošo ģenētisko defektu korekcijai, jo šo gēnu produkti spēj kompensēt dažādas centrālās nervu sistēmas bioķīmiskās anomālijas. Transfektēto cilmes šūnu augstā migrācijas aktivitāte un atbilstoša implantācija dažādu attīstošo smadzeņu apgabalu germinālajās zonās ļauj cerēt uz pilnīgu iedzimta šūnu enzīmu deficīta atjaunošanos. Modelējot ataksijas-telangiektāzijas sindromu (mutantu peļu līnijas pg un pcd), Purkinje šūnas izzūd no eksperimentālo dzīvnieku smadzenītēm pirmajās postnatālās attīstības nedēļās. Ir pierādīts, ka neironu cilmes šūnu ievadīšana šādu dzīvnieku smadzenēs notiek ar to diferenciāciju Purkinje šūnās un granulārajos neironos. pcd mutantos kustību koordinācijas traucējumi tiek daļēji koriģēti un trīces intensitāte samazinās. Līdzīgi rezultāti tika iegūti, transplantējot klonētas cilvēka neironu cilmes šūnas primātiem, kuriem, izmantojot onkonāzi, tika inducēta Purkinje šūnu deģenerācija. Pēc transplantācijas donora neironu cilmes šūnas tika atrastas smadzenīšu parenhīmas granulārajā, molekulārajā un Purkinje šūnu slānī. Tādēļ neironu cilmes šūnu ģenētiskā modifikācija var nodrošināt stabilu, apņēmīgu fenotipa modifikāciju, kas ir izturīga pret ārējām ietekmēm. Tas ir īpaši svarīgi patoloģiskos procesos, kas saistīti ar tādu faktoru attīstību recipientā, kas novērš donoru šūnu izdzīvošanu un diferenciāciju (piemēram, imūnās agresijas laikā).

Cilvēkam VII tipa mukopolisaharidozi raksturo neirodeģenerācija un progresējoša intelektuālā invaliditāte, ko pelēm modelē delēcijas mutācija beta-glikuronidāzes gēnā. Pēc transfektētu neironu cilmes šūnu, kas sekretē beta-glikuronidāzi, transplantācijas jaundzimušu defektīvu recipientu peļu smadzeņu kambaros, donora šūnas vispirms tiek atrastas terminālajā zonā un pēc tam izplatās pa visu smadzeņu parenhīmu, stabili koriģējot lizosomu integritāti mutantu peļu smadzenēs. Teja-Saksa slimības modelī ar retrovīrusu transducētas neironu cilmes šūnas, in utero ievadītas peļu augļiem un transplantētas jaundzimušām pelēm, nodrošina efektīvu beta-heksozaminidāzes beta apakšvienības ekspresiju recipientiem ar mutāciju, kas izraisa patoloģisku beta2-gangliozīda uzkrāšanos.

Vēl viens reģeneratīvās medicīnas virziens ir pacienta paša neironu cilmes šūnu proliferatīvā un diferenciācijas potenciāla stimulēšana. Jo īpaši neironu cilmes šūnas izdala NT-3 muguras smadzeņu hemisekcijas un smadzeņu asfiksijas laikā žurkām, ekspresē NGF un BDNF starpsienā un bazālajos ganglijos, tirozīna hidroksilāzes striatumā, kā arī reelīnu smadzenītēs un mielīna bāzes proteīnu smadzenēs.

Tomēr neiroģenēzes stimulācijas jautājumiem acīmredzami netiek pievērsta pietiekama uzmanība. Daži pētījumi liecina, ka funkcionālā slodze uz nervu centriem, kas ir atbildīgi par smaržu atšķiršanu, atspoguļojas jaunu neironu veidošanā. Transgēnām pelēm ar neironu adhēzijas molekulu deficītu neiroģenēzes intensitātes samazināšanās un neironu skaita samazināšanās, kas migrē uz ožas sīpoliem, tika apvienota ar smaržu atšķiršanas spējas traucējumiem, lai gan smaržu uztveres slieksnis un īstermiņa ožas atmiņa netika traucēta. Zobainā vijuma šūnu funkcionālajam stāvoklim ir svarīga loma neiroģenēzes regulēšanā: glutamāta ietekmes uz granulārajām šūnām pavājināšanās pēc entorhinālās garozas iznīcināšanas veicina neironu proliferāciju un diferenciāciju, un perforējošā ceļa šķiedru (galvenā aferentā ieeja hipokampā) stimulācija izraisa neiroģenēzes inhibīciju. NMDA receptoru antagonisti aktivizē jaunu neironu veidošanās procesus, savukārt agonisti, gluži pretēji, samazina neiroģenēzes intensitāti, kas pēc savas būtības atgādina glikokortikosteroīdu darbību. Literatūrā ir atrodami pretrunīgi pētījumu rezultāti: informācija par eksperimentāli pierādīto ierosinošā neirotransmitera glutamāta inhibējošo ietekmi uz neiroģenēzi neatbilst datiem par cilmes šūnu proliferācijas stimulēšanu un jaunu neironu parādīšanos ar krampju aktivitātes palielināšanos dzīvnieku hipokampā ar eksperimentāliem kaīna un pilokarpīna epilepsijas modeļiem. Tajā pašā laikā tradicionālajā epilepsijas modelī, ko izraisa noteiktas smadzeņu zonas daudzkārtēja zem sliekšņa stimulācija (aizdegšanās) un kam raksturīga mazāk izteikta neironu nāve, neiroģenēzes intensitāte palielinās tikai aizdegšanās vēlīnā fāzē, kad hipokampā tiek novēroti neironu bojājumi un nāve. Ir pierādīts, ka epilepsijas gadījumā krampju aktivitāte stimulē neiroģenēzi ar jaunu granulāro neironu patoloģisku lokalizāciju, no kuriem daudzi parādās ne tikai zobainajā girusā, bet arī hilusā. Šādiem neironiem ir liela nozīme sūnaino šķiedru dīgšanas attīstībā, jo to aksoni veido normāli neesošus apgrieztos kolaterāļus, kas veido daudzas sinapses ar blakus esošajām granulārajām šūnām.

Reģionālo neironu cilmes šūnu izmantošana paver jaunas perspektīvas šūnu transplantācijas pielietošanai vielmaiņas un ģenētisko neirodeģeneratīvo slimību, demielinizējošo slimību un centrālās nervu sistēmas posttraumatisko traucējumu ārstēšanā. Pirms aizvietojošās šūnu transplantācijas veikšanas saskaņā ar vienu no metodēm, tiek veikta nepieciešamā neironu cilmes šūnu tipa atlase un pavairošana ex vivo ar mērķi tās pēc tam ievadīt tieši smadzeņu bojātajā zonā. Terapeitiskā iedarbība šajā gadījumā ir saistīta ar bojāto šūnu aizvietošanu vai augšanas faktoru un citokīnu lokālu izdalīšanos. Šī reģeneratīvi plastiskās terapijas metode prasa pietiekami liela skaita šūnu transplantāciju ar iepriekš noteiktām funkcionālām īpašībām.

Būtu jāuzskata par lietderīgiem arī turpmākus pētījumus par nobriedušu smadzeņu cilmes šūnu molekulārajām īpašībām un reģeneratīvi plastisko potenciālu, kā arī par dažādu audu izcelsmes reģionālo cilmes šūnu spēju transdiferencēties. Mūsdienās jau ir veikta kaulu smadzeņu hematopoētisko cilmes šūnu antigēnu skrīnings, nosakot šūnu marķieru kombināciju, kas spēj transdiferencēties par neironu cilmes cilmes cilmes šūnām (CD 133+, 5E12+, CD34-, CD45-, CD24). Ir iegūtas šūnas, kas in vitro veido neirosfēras un veido neironus, transplantējot tās jaundzimušu imūndeficīta peļu smadzenēs. Šūnu ksenotransplantoloģijai interesanti ir pētījumu rezultāti par cilmes šūnu krusteniskās transplantācijas iespējamību evolucionāri attālu taksonu indivīdiem. Neirālo cilmes šūnu implantācijas rezultāti smadzeņu audzēja zonā paliek bez pienācīgas interpretācijas: transplantētās šūnas aktīvi migrē visā audzēja tilpumā, nepārsniedzot tā robežas, un, kad šūnas tiek ievadītas neskartajā smadzeņu daļā, tiek novērota to aktīva migrācija audzēja virzienā. Jautājums par šādas migrācijas bioloģisko nozīmi paliek atklāts.

Jāatzīmē, ka veiksmīga neironu cilmes šūnu, kā arī citu no ESŠ iegūtu neironu cilmes šūnu transplantācija ir iespējama tikai tad, ja tiek izmantotas augsti attīrītas neironu cilmes šūnas, jo nediferencētas embrionālās cilmes šūnas, transplantējot pieaugušam imūnkompetentam recipientam, neizbēgami pārveidojas par teratomām un teratokarcinomām. Pat minimāls slikti diferencētu šūnu daudzums donora šūnu suspensijā strauji palielina transplantāta tumorogenitāti un nepieņemami palielina audzēja attīstības vai neirālo audu veidošanās risku. Homogēnu neironu cilmes šūnu populāciju iegūšana ir iespējama, ja kā alternatīvu donora audu avotu tiek izmantotas šūnas, kas rodas noteiktos normālas embrioģenēzes posmos. Cita pieeja ietver nevēlamu šūnu populāciju rūpīgu elimināciju, izmantojot ciltsrakstam specifisku atlasi. Bīstama ir arī ESŠ izmantošana neirotransplantācijai pēc to nepietiekamas iedarbības in vitro ar augšanas faktoriem. Šajā gadījumā nevar izslēgt neironu diferenciācijas programmas neveiksmi ar neironu caurulei raksturīgo struktūru veidošanos.

Mūsdienās ir pilnīgi acīmredzams, ka neironu cilmes šūnas uzrāda tropismu patoloģiski izmainītām centrālās nervu sistēmas zonām un tām ir izteikta reģeneratīvi plastiska iedarbība. Nervu audu šūnu nāves vietas mikrovide modelē transplantēto šūnu diferenciācijas virzienu, tādējādi papildinot specifisku neironu elementu deficītu CNS bojājuma zonā. Dažos neirodeģeneratīvos procesos rodas neirogēni signāli neiroģenēzes atkārtošanai, un nobriedušu smadzeņu neironu cilmes šūnas spēj reaģēt uz šo pamācošo informāciju. Neskaitāmi eksperimentāli dati kalpo kā skaidrs neironu cilmes šūnu terapeitiskā potenciāla ilustrācija. Neirālo cilmes šūnu klona intracisternāla ievadīšana dzīvniekiem ar vidējās smadzeņu artērijas ligāciju (išēmiska insulta modelis) palīdz samazināt destruktīvi izmainītā smadzeņu apgabala laukumu un tilpumu, īpaši neironu cilmes šūnu transplantācijas gadījumā kopā ar FGF2. Imunocitoķīmiski tiek novērota donoru šūnu migrācija uz išēmisko zonu ar sekojošu integrāciju ar neskartām recipienta smadzeņu šūnām. Peļu neiroepitēlija līnijas MHP36 nenobriedušu šūnu transplantācija žurku smadzenēs ar eksperimentālu insultu uzlabo sensoromotorisko funkciju, un šo šūnu ievadīšana smadzeņu kambaros uzlabo kognitīvo funkciju. Neirāli preformētu cilvēka kaulu smadzeņu hematopoētisko šūnu transplantācija žurkām novērš išēmiska bojājuma izraisītu smadzeņu garozas disfunkciju. Šajā gadījumā ksenogēnās neironu cilmes šūnas migrē no injekcijas vietas uz smadzeņu audu destruktīvo izmaiņu zonu. Homologu kaulu smadzeņu šūnu intrakraniāla transplantācija žurku smadzeņu garozas traumatiska bojājuma gadījumā noved pie daļējas motorās funkcijas atjaunošanas. Donora šūnas iesakņojas, proliferējas, tiek pakļautas neironu diferenciācijai neironos un astrocītos un migrē uz bojājumu. Injicējot pieaugušu žurku striatumā ar eksperimentālu insultu, klonētas cilvēka neironu cilmes šūnas aizstāj bojātās CNS šūnas un daļēji atjauno traucēto smadzeņu darbību.

Cilvēka neironu cilmes šūnas galvenokārt tiek izolētas no embrionālā telencephalona, kas attīstās daudz vēlāk nekā kaudālāk izvietotās nervu stumbra daļas. Ir pierādīta iespēja izolēt neironu cilmes šūnas no 43–137 dienas veca cilvēka augļa muguras smadzenēm, jo EGF un FGF2 klātbūtnē šīs šūnas veido neirosfēras un agrīnās pasāžās uzrāda multipotenci, diferencējoties par neironiem un astrocītiem. Tomēr neironu cilmes šūnu ilgstoša kultivēšana (ilgāk par 1 gadu) atņem tām multipotenci – šādas šūnas spēj diferencēties tikai par astrocītiem, t.i., tās kļūst unipotentas. Reģionālās neironu cilmes šūnas var iegūt daļējas bulbektomijas rezultātā un pēc pavairošanas kultūrā LIF klātbūtnē transplantēt tam pašam pacientam ar neirodeģeneratīvām izmaiņām citās centrālās nervu sistēmas daļās. Klīnikā aizstājējšūnu terapija, izmantojot neironu cilmes šūnas, pirmo reizi tika veikta, lai ārstētu pacientus ar insultu, ko pavada smadzeņu bazālo gangliju bojājumi. Donoru šūnu transplantācijas rezultātā tika novērota vairuma pacientu klīniskā stāvokļa uzlabošanās.

Daži autori uzskata, ka neironu cilmes šūnu spēja iesakņoties, migrēt un integrēties dažādās nervu audu zonās CNS bojājumu gadījumā paver neierobežotas iespējas šūnu terapijai ne tikai lokālu, bet arī plašu (insulta vai asfiksijas), multifokālu (multiplās sklerozes) un pat globālu (lielākā daļa iedzimtu vielmaiņas traucējumu vai neirodeģeneratīvo demenču) patoloģisku procesu gadījumā. Patiešām, kad klonētas peles un cilvēka neironu cilmes šūnas tiek transplantētas recipientiem dzīvniekiem (attiecīgi pelēm un primātiem) ar dopamīnerģisko neironu deģenerāciju mezostriatālajā sistēmā, ko izraisa metilfeniltetrapiridīna (Parkinsona slimības modelis) ievadīšana 8 mēnešus pirms transplantācijas, donora neironu cilmes šūnas integrējas recipienta CNS. Mēnesi vēlāk transplantētās šūnas tiek lokalizētas divpusēji gar vidussmadzenēm. Daži no iegūtajiem donora izcelsmes neironiem ekspresē tirozīna hidrolāzi, ja nav imūnās reakcijas pazīmju pret transplantātu. Žurkām, kurām tika ievadīts 6-hidroksidopamīns (vēl viens Parkinsona slimības eksperimentāls modelis), transplantēto šūnu adaptāciju saimnieka smadzeņu mikrovidē noteica neironu cilmes šūnu kultivēšanas apstākļi pirms to transplantācijas. Neirālās cilmes šūnas, kas in vitro strauji vairojās EGF ietekmē, efektīvāk kompensēja dopamīnerģisko neironu deficītu bojātajā striatumā nekā šūnas no 28 dienu kultūrām. Autori uzskata, ka tas ir saistīts ar spēju uztvert atbilstošos diferenciācijas signālus neironu cilmes šūnu dalīšanās procesā in vitro.

Dažos pētījumos tika mēģināts palielināt ietekmes efektivitāti uz bojātā striatuma reinnervācijas procesiem, transplantējot embrionālās striatuma šūnas šajā zonā kā neirotrofisko faktoru avotu ar vienlaicīgu ventrālā mezencefalona dopamīnerģisko neironu transplantāciju. Izrādījās, ka neirotransplantācijas efektivitāte lielā mērā ir atkarīga no embrionālo nervu audu ievadīšanas metodes. Pētījumu rezultātā par embrionālo nervu audu preparātu transplantāciju smadzeņu kambaru sistēmā (lai izvairītos no striatuma parenhīmas bojājumiem) tika iegūta informācija par to pozitīvo ietekmi uz motorisko defektu parkinsonismā.

Tomēr citos pētījumos eksperimentāli novērojumi ir parādījuši, ka dopamīnerģiskos neironus saturošu ventrālā mezencephalona embrionālo nervu audu preparātu transplantācija smadzeņu kambarī, kā arī GABA-erģisko embrionālo neironu elementu transplantācija žurku ar hemiparkinsonismu striatumā neveicina dopamīnerģiskās sistēmas traucēto funkciju atjaunošanos. Gluži pretēji, imūnhistoķīmiskā analīze apstiprināja datus par žurku striatumā transplantēto ventrālā mezencephalona dopamīnerģisko neironu zemo izdzīvošanas līmeni. Ventrālā mezencephalona embrionālo nervu audu intraventrikulāras transplantācijas terapeitiskais efekts tika realizēts tikai tad, ja vienlaikus denervētā striatumā tika implantēts embrionālo striatālo šūnu preparāts. Autori uzskata, ka šī efekta mehānisms ir saistīts ar embrionālā striatuma GABA-erģisko elementu pozitīvo trofisko ietekmi uz intraventrikulāro ventrālā mezencephalona transplantātu specifisko dopamīnerģisko aktivitāti. Izteikta gliju reakcija transplantātos bija saistīta ar nelielu apomorfīna testa parametru regresiju. Pēdējais savukārt korelēja ar GFAP saturu asins serumā, kas tieši norādīja uz hematoencefāliskā barjeras caurlaidības pārkāpumu. Pamatojoties uz šiem datiem, autori secināja, ka GFAP līmenis asins serumā var tikt izmantots kā atbilstošs kritērijs transplantāta funkcionālā stāvokļa novērtēšanai, un paaugstināta hematoencefāliskā barjeras caurlaidība neirospecifiskiem antigēniem, piemēram, GFAP, ir patogēna saikne transplantācijas neveiksmes attīstībā recipienta nervu audu autoimūnu bojājumu dēļ.

No citu pētnieku viedokļa, neironu cilmes šūnu iesakņošanās un integrācija pēc transplantācijas ir stabila un ilgstoša, jo donoru šūnas recipientos ir atrodamas vismaz divus gadus pēc transplantācijas un bez būtiskas to skaita samazināšanās. Mēģinājumus to izskaidrot ar to, ka nediferencētā stāvoklī neironu cilmes šūnas neizpauž MHC I un II klases molekulas tādā līmenī, kas būtu pietiekams, lai izraisītu imūnās atgrūšanas reakciju, var uzskatīt par patiesiem tikai attiecībā uz mazdiferencētiem neironu prekursoriem. Tomēr ne visas neironu cilmes šūnas recipienta smadzenēs ir saglabājušās nenobriedušā miera stāvoklī. Lielākā daļa no tām piedzīvo diferenciāciju, kuras laikā MHC molekulas tiek pilnībā ekspresētas.

Jo īpaši nepietiekamā dopamīnerģiskos neironus saturošu embrionālo ventrālo mezencephalonu intrastriatālas transplantācijas izmantošanas efektivitāte eksperimentāla parkinsonisma ārstēšanā ir saistīta ar transplantēto dopamīnerģisko neironu zemo izdzīvošanas rādītāju (tikai 5–20%), ko izraisa reaktīvā glioze, kas pavada lokālu smadzeņu parenhīmas traumu transplantācijas laikā. Ir zināms, ka lokāla smadzeņu parenhīmas trauma un vienlaicīga glioze noved pie hematoencefāliskā barjeras integritātes traucējumiem, izlaižot nervu audu antigēnus, jo īpaši OCAR un neironspecifisku antigēnu, perifērajās asinīs. Šo antigēnu klātbūtne asinīs var izraisīt specifisku citotoksisku antivielu veidošanos pret tiem un autoimūnas agresijas attīstību.

V. Cimbaljuks un līdzautori (2001) ziņo, ka joprojām pastāv tradicionālais viedoklis, saskaņā ar kuru centrālā nervu sistēma ir imunoloģiski privileģēta zona, ko no imūnsistēmas izolē hematoencefāliskā barjera. Savā literatūras apskatā autori citē vairākus darbus, kas norāda, ka šis viedoklis pilnībā neatbilst imūnprocesu būtībai zīdītāju smadzenēs. Ir konstatēts, ka iezīmētas vielas, kas ievadītas smadzeņu parenhīmā, var sasniegt dziļos kakla limfmezglus, un pēc antigēnu intracerebrālas injekcijas organismā veidojas specifiskas antivielas. Kakla limfmezglu šūnas reaģē uz šādiem antigēniem ar proliferāciju, sākot ar 5. dienu pēc injekcijas. Specifisku antivielu veidošanās ir atklāta arī ādas transplantācijas laikā smadzeņu parenhīmā. Apskata autori sniedz vairākus hipotētiskus antigēnu transportēšanas ceļus no smadzenēm uz limfātisko sistēmu. Viens no tiem ir antigēnu pāreja no perivaskulārajām telpām uz subarahnoidālo telpu. Tiek pieņemts, ka perivaskulārās telpas, kas lokalizētas gar smadzeņu lielajiem asinsvadiem, ir līdzvērtīgas limfātiskajai sistēmai smadzenēs. Otrais ceļš ved pa baltajām šķiedrām – caur sietveida kaulu deguna gļotādas limfvados. Turklāt cietajā apvalkā ir plašs limfvadu tīkls. Arī asins-smadzeņu barjeras necaurlaidība limfocītiem ir diezgan relatīva. Ir pierādīts, ka aktivētie limfocīti spēj ražot enzīmus, kas ietekmē smadzeņu "imūnfiltra" struktūru caurlaidību. Postkapilāro venulu līmenī aktivētie T-helperi iekļūst neskartajā asins-smadzeņu barjerā. Tēze par šūnu neesamību smadzenēs, kas pārstāv antigēnus, neiztur kritiku. Pašlaik ir pārliecinoši pierādīta iespēja, ka antigēnus CNS pārstāv vismaz trīs veidu šūnas. Pirmkārt, tās ir no kaulu smadzenēm iegūtas dendritiskās šūnas, kas lokalizējas smadzenēs gar lielajiem asinsvadiem un baltajā vielā. Otrkārt, antigēni spēj prezentēt smadzeņu asinsvadu endotēlija šūnas, un saistībā ar MHC antigēniem, kas atbalsta šiem antigēniem specifisku T šūnu klonālo augšanu. Treškārt, mikro- un astrogliju šūnas darbojas kā antigēnus prezentējoši aģenti. Piedaloties imūnās atbildes veidošanā centrālajā nervu sistēmā, astrocīti iegūst imūnās efektora šūnas īpašības un ekspresē vairākus antigēnus, citokīnus un imūnmodulatorus. Inkubējot ar γ-interferonu (γ-INF), astrogliālās šūnas in vitro ekspresē MHC I un II klases antigēnus, un stimulētie astrocīti spēj prezentēt antigēnus un uzturēt limfocītu klonālo proliferāciju.

Smadzeņu audu traumas, pēcoperācijas iekaisums, tūska un fibrīna nogulsnes, kas pavada embrionālo nervu audu transplantāciju, rada apstākļus paaugstinātai hematoencefāliskajai barjerai ar traucētu autotoleranci, sensibilizāciju un CD3+CD4+ limfocītu aktivāciju. Auto- un alloantigēnu prezentāciju veic astrocīti un mikrogliju šūnas, kas reaģē uz y-INF, ekspresējot MHC molekulas, ICAM-1, LFA-I, LFA-3, kostimulējošās molekulas B7-1 (CD80) un B7-2 (CD86), kā arī sekrēciju IL-la, IL-ip un y-INF.

Līdz ar to embrionālo nervu audu ilgāka izdzīvošana pēc intracerebrālas transplantācijas nekā pēc to perifēras ievadīšanas diez vai var tikt saistīta ar transplantāta imunitātes neieviešanu. Turklāt monocītiem, aktivētajiem limfocītiem (citotoksiskām CD3+CD8+ un T-palīga šūnām) un to producētajiem citokīniem, kā arī antivielām pret embrionālo nervu audu perifērās transplantāta antigēniem ir liela nozīme tā atgrūšanas procesā. Zems MHC molekulu ekspresijas līmenis embrionālajos nervu audos ir zināma nozīme, lai radītu apstākļus neirotransplantātu ilgākai rezistencei pret T šūnu imūnprocesiem. Tāpēc eksperimentā imūnais iekaisums pēc embrionālo nervu audu transplantācijas smadzenēs attīstās lēnāk nekā pēc ādas transplantācijas. Tomēr pēc 6 mēnešiem tiek novērota pilnīga atsevišķu nervu audu transplantātu iznīcināšana. Šajā gadījumā T-limfocīti, ko ierobežo MHC II klases antigēni, galvenokārt lokalizējas transplantācijas zonā (Nicholas et al., 1988). Eksperimentāli ir pierādīts, ka ksenoloģiskās neirotransplantācijas laikā T-helperu (L3T4+), bet ne citotoksisko T-limfocītu (Lyt-2), samazināšanās paildzina žurku nervu audu izdzīvošanu recipientu peļu smadzenēs. Neirotransplantāta atgrūšanu pavada tā infiltrācija ar saimnieka makrofāgiem un T-limfocītiem. Līdz ar to saimnieka makrofāgi un aktivētās mikrogliju šūnas darbojas in situ kā antigēnus prezentējošas imūnstimulējošas šūnas, un donora MHC I klases antigēnu ekspresijas palielināšanās pastiprina recipientu citotoksisko T-limfocītu killeraktivitāti.

Nav jēgas analizēt daudzos spekulatīvos mēģinājumus izskaidrot neirotransplantāta atgrūšanas faktu ar recipienta imūnsistēmas reakciju uz donora endotēlija šūnām vai glijas elementiem, jo pat tīras neironu cilmes šūnu līnijas ir pakļautas imūnsistēmas uzbrukumam. Jāatzīmē, ka Fas ligandu ekspresijai smadzeņu šūnās, kas saistās ar apoptozes receptoriem (Fas molekulām) uz smadzenēs infiltrējošajiem T limfocītiem un inducē to apoptozi, ir svarīga loma ilgākas transplantāta izdzīvošanas mehānismos CNS, kas ir tipisks transbarjeras autoimunogēno audu aizsargmehānisms.

Kā pareizi atzīmē V. Cimbaljuks un līdzautori (2001), embrionālo nervu audu transplantācijai raksturīga iekaisuma attīstība, kurā piedalās šūnas, kas sensibilizētas pret smadzeņu antigēniem, un aktivētas šūnas, antivielas, kā arī citokīnu lokālas producēšanas rezultātā. Svarīga loma tajā ir jau esošajai organisma sensibilizācijai pret smadzeņu antigēniem, kas rodas CNS slimību attīstības laikā un var būt vērsta pret transplantācijas antigēniem. Tāpēc histoinkompatibilu neirotransplantātu patiesi ilgstoša izdzīvošana tiek panākta, tikai nomācot imūnsistēmu ar ciklosporīnu A vai ievadot monoklonālas antivielas pret recipienta CD4+ limfocītiem.

Tādējādi daudzas neirotransplantācijas problēmas joprojām nav atrisinātas, tostarp tās, kas saistītas ar audu imunoloģisko saderību, kuras var atrisināt tikai pēc mērķtiecīgiem fundamentāliem un klīniskiem pētījumiem.