Asinsradnieciskās cilmes šūnas no nabassaites asinīm

Nabassaites asinis ir labs hematopoētisko cilmes šūnu avots, ņemot vērā hematopoētisko šūnu proliferācijas potenciālu un repopulācijas spējas. Ir atkārtoti pierādīts, ka līdz dzimšanas brīdim nabassaites asinīs ir pietiekami liels skaits vāji piesaistītu hematopoētisko cilmes šūnu. Daži autori uzskata, ka nabassaites asiņu hematopoētisko cilmes šūnu transplantācijas priekšrocība ir nepieciešamība meklēt donoru, kas ir saderīgs ar HLA antigēniem. Viņuprāt, jaundzimušā imūnsistēmas nenobriedums izraisa samazinātu imūnkompetento šūnu funkcionālo aktivitāti un attiecīgi zemāku smagas transplantāta pret saimnieka slimības sastopamību nekā kaulu smadzeņu transplantācijas gadījumā. Tajā pašā laikā nabassaites asiņu šūnu transplantācijas izdzīvošanas rādītājs nav zemāks nekā kaulu smadzeņu šūnām, pat ja tiek izmantots mazāks HSC skaits, kas ievadīts uz 1 kg pacienta ķermeņa masas. Tomēr, mūsuprāt, nopietnāka analīze nepieciešama jautājumiem par optimālo transplantēto nabassaites asiņu šūnu skaitu, kas nepieciešams efektīvai iesakņošanai recipienta organismā, to imunoloģisko saderību un vairākiem citiem nabassaites asiņu hematopoētisko cilmes šūnu transplantācijas problēmas aspektiem.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Hematopoētisko cilmes šūnu iegūšana no nabassaites asinīm

Procedūra hematopoētisko cilmes šūnu iegūšanai no nabassaites asinīm paredz to savākšanu tūlīt pēc bērna piedzimšanas un atdalīšanu no placentas, kad placenta atrodas dzemdē vai ex utero, kā arī ķeizargrieziena laikā, bet arī ex utero. Ir pierādīts, ka, ja laiks no dzimšanas brīža līdz jaundzimušā atdalīšanai no placentas tiek samazināts līdz 30 sekundēm, iegūto nabassaites asiņu tilpums palielinās vidēji par 25–40 ml. Ja šī procedūra tiek veikta vēlāk, tiek zaudēts tāds pats asiņu daudzums. Ir konstatēts, ka bērna agrīna atdalīšanās no placentas nerada nekādas negatīvas sekas jaundzimušajam.

Krievijas Hematoloģijas un transfuzioloģijas pētniecības institūts ir izstrādājis efektīvas un lētas tehnoloģijas nabassaites asiņu iegūšanai gan normālu dzemdību laikā ((70,2+25,8) ml), gan ķeizargrieziena operācijas laikā ((73,4+25,1) ml). Ir ierosināta nabassaites asiņu atdalīšanas metode ar pietiekami augstu kodolu un mononukleāro šūnu ražu - attiecīgi (83,1+9,6) un (83,4+14,1)%. Ir uzlabota nabassaites asiņu kriokonservēšanas metode, kas nodrošina augstu mononukleāro šūnu un CFU-GM saglabāšanos - attiecīgi (96,8+5,7) un (89,6+22,6)%. Ir noteikta drenāžas metodes efektivitāte nabassaites asiņu savākšanai, izmantojot Kompoplast-300 konteineru (Krievija). Autori savāca nabassaites asinis tūlīt pēc bērna piedzimšanas un tā atdalīšanās no placentas, placentas novietojuma dzemdē vai ex utero apstākļos. Pirms nabassaites vēnas punkcijas nabassaiti vienu reizi apstrādāja ar 5% joda tinktūru un pēc tam divas reizes ar 70% etilspirtu. Asinis spontāni ieplūda traukā caur savienojošajām caurulītēm. Savākšanas procedūra ilga ne vairāk kā 10 minūtes. Ar drenāžu savākto 66 nabassaites asiņu paraugu vidējais tilpums bija (72+28) ml, un leikocītu skaits vidējā kopējā parauga tilpumā bija (1,1+0,6) x 107. Analizējot nabassaites asiņu sterilitāti (baktēriju piesārņojums, HIV-1, B un C hepatīta vīrusi, sifiliss un citomegalovīrusa infekcija), IgG antivielas pret C hepatīta vīrusu tika konstatētas tikai vienā paraugā. Citā pētījumā placenta tūlīt pēc piedzimšanas tika novietota ar augļa virsmu uz leju uz speciāla rāmja, nabassaite tika apstrādāta ar 5% joda šķīdumu un 75% etilspirtu. Nabassaites vēna tika drenēta, izmantojot adatu no transfūzijas sistēmas (G16). Asinis traukā ieplūda spontāni. Šādi savākto asiņu vidējais tilpums bija (55+25) ml. G. Koglera u.c. darbā... (1996) nabassaites asinis tika savāktas, izmantojot slēgtu metodi, un tika iegūti lieli asins tilpumi - vidēji (79+26) ml. Autori norāda, ka no 574 nabassaites asiņu paraugiem aptuveni 7% saturēja mazāk par 40 ml asiņu, kas neļauj tos izmantot transplantācijai. K. Isoyama et al. (1996), savācot nabassaites asinis ar aktīvu eksfūziju, izmantojot šļirces, ieguva vidēji 69,1 ml asiņu (nabassaites asiņu tilpums svārstījās no 15 līdz 135 ml). Visbeidzot, A. Abdel-Mageed PI et al. (1997) izdevās iegūt vidēji 94 ml nabassaites asiņu (no 56 līdz 143 ml), kateterizējot nabassaites vēnu.

Lai samazinātu jatrogēnas infekcijas un mātes sekrēciju piesārņojuma risku, ir izstrādāta slēgta asins savākšanas sistēma, kuras pamatā ir plaši izmantotā Baxter Healthcare Corp., Dīrfīlda, Ilinoisa (ASV) pārliešanas sistēma, kas satur 62,5 ml CPDA (citrāta-fosfāta-dekstrozes ar adenīnu) kā antikoagulantu. Materiāla iegūšanas tehnoloģijai ir primāra nozīme augstas kvalitātes parauga sagatavošanā šūnu suspensijas tilpuma, satura un tīrības ziņā. No esošajām nabassaites asiņu savākšanas metodēm, kuras parasti klasificē slēgtās, daļēji atvērtās un atvērtās sistēmās, priekšroka jādod pirmajai, jo slēgtā sistēma ievērojami samazina materiāla mikrobiālā piesārņojuma risku, kā arī šūnu suspensijas piesārņojuma risku ar mātes šūnām.

A. Naglers un līdzautori (1998) veica visu trīs nabassaites asiņu savākšanas sistēmu efektivitātes salīdzinošu analīzi. Pirmajā variantā procedūra tika veikta slēgtā sistēmā, eksfoliējot asinis tieši traukā. Otrajā variantā nabassaites asinis tika iegūtas, aktīvi izsūknējot asinis ar MP1 šļirci, kam sekoja placentas vēnu skalošana un vienlaicīga asiņu novadīšana traukā (atvērtā metode). Trešajā variantā asinis tika savāktas daļēji atvērtā sistēmā, aktīvi izsūknējot tās ar šļircēm un izskalojot caur nabas artēriju, vienlaikus izsūknējot traukā. Pirmajā variantā autori ieguva nabassaites asinis (76,4+32,1) ml tilpumā ar leikocītu saturu (10,5+3,6) x 106 ¹ ml asiņu. Otrajā variantā atbilstošie rādītāji bija (174,4+42,8) ml un (8,8+3,4) x 106 ^/ ml; trešajā - (173,7+41,3) ml un (9,3+3,8) x 106 ^/ ml. Visbiežāk nabassaites asiņu paraugu infekcija tika novērota, izmantojot atvērto sistēmu. Tika konstatēta tieša korelācija starp placentas masu un iegūto asiņu tilpumu - palielinoties placentas masai, palielinās savākto asiņu daudzums.

Pēc nabassaites asiņu savākšanas seko atdalīšanas posms - mononukleāro šūnu izolēšana un šūnu suspensijas attīrīšana no eritrocītiem. Eksperimentālos apstākļos kodolu šūnas tiek izolētas, sedimentējot ar metilcelulozi eritrocītu līzes laikā ar amonija hlorīdu. Tomēr metilcelulozi nevajadzētu izmantot klīniskiem mērķiem, jo hematopoētisko cilmes šūnu zudumi uz tās sasniedz 50-90%. Eritrocītu līze klīnikā gandrīz nekad netiek veikta darba šķīduma lielā tilpuma dēļ, lai gan kodolu šūnu ar CD34+ fenotipu, kā arī cilmes šūnu ar CFU-GM un CFU-GEMM funkcijām izolēšanas procentuālā daļa šādā veidā ir ievērojami lielāka. Ir ziņots par jauna līdzekļa mononukleāro šūnu izolēšanai blīvuma gradientā, bujanta blīvuma šķīdumā (BDS72), parādīšanos. Šai vielai ir šādi fizioloģiskie parametri: pH - 7,4, osmolalitāte - 280 mOsm/kg, blīvums - 1,0720 g/ml. Pēc autoru domām, to var izmantot, lai izolētu līdz pat 100 % CD34 pozitīvu šūnu un izņemtu 98 % eritrocītu. Tomēr BDS72 klīnikā vēl netiek izmantots.

Apstiprinātajās kodolu šūnu izolēšanas metodēs no nabassaites asinīm parasti izmanto 10% hidroksietilcietes šķīdumu vai 3% želatīna šķīdumu. Eritrocītu sedimentācijas un kodolu šūnu izolēšanas efektivitāte abos gadījumos ir aptuveni vienāda. Tomēr, ja želatīnu izmanto kā sedimentācijas līdzekli, ir iespējams iegūt nedaudz lielāku CFU-GM daudzumu nekā lietojot hidroksietilcieti. Tiek pieņemts, ka CFU-GM izolēšanas efektivitātes atšķirības ir saistītas ar atsevišķu kodolu šūnu frakciju atšķirīgo sedimentācijas ātrumu vai hidroksietilcietes molekulu spēju absorbēties uz hematopoētisko šūnu receptoru virsmas un tādējādi bloķēt to jutību pret kolonijas stimulējošiem faktoriem, ko izmanto CFU-GM kultivēšanā in vitro. Tomēr abi sedimentatori var būt piemēroti kodolu šūnu izolēšanai, veidojot liela mēroga nabassaites asiņu bankas.

Nabassaites asiņu atdalīšanas un kriokonservācijas metodes būtībā neatšķiras no tām, ko izmanto darbā ar pieaugušo donoru perifēro asiņu un kaulu smadzeņu hematopoētiskajām cilmes šūnām. Taču, sagatavojot lielu skaitu nabassaites asiņu paraugu bankām, atdalīšanas metodēm, pirmkārt, jābūt lētām. Tāpēc diemžēl pašlaik klīnisko vajadzību apmierināšanai tiek izmantotas jau pārbaudītas rutīnas nabassaites asiņu šūnu izolēšanas un kriokonservācijas metodes, un eksperimentētāju ziņā joprojām ir efektīvākas, bet dārgākas metodes.

Kopumā ir apstiprināti kritēriji hematopoētisko šūnu skaita novērtēšanai un prasības nabassaites asiņu paraugu izmeklēšanai, lai identificētu infekcijas izraisītājus. Lai nodrošinātu nabassaites asiņu hematopoētisko šūnu transplantācijas drošību, visi asins paraugi galvenokārt jāpārbauda attiecībā uz hematogēni pārnestām infekcijām un ģenētiskām slimībām. Vairāki autori iesaka papildu īpašas metodes nabassaites asiņu izmeklēšanai, lai diagnosticētu tādas ģenētiskas slimības kā a-talasēmija, sirpjveida šūnu anēmija, adenozīna deamināzes deficīts, Brutona agammaglobulinēmiju, Hērlera un Pontera slimības.

Saskaņā ar L. Ticheli un līdzautoru ieteikumiem (1998), katrs nabassaites asiņu paraugs ir jāpārbauda uz kodolu šūnām, CD34 pozitīvām šūnām un CFU-GM, jāveic HLA tipēšana un jānosaka asinsgrupa atbilstoši ABO un tā Rh faktoram. Papildus jāveic bakterioloģiskā kultivēšana, seroloģiskā pārbaude uz HIV un citomegalovīrusa infekciju, HBsAg, vīrushepatītu C, HTLY-I un HTLV-II (cilvēka T šūnu leikēmiju), sifilisu un toksoplazmozi. Obligāti jāveic polimerāzes ķēdes reakcija uz citomegalovīrusu un HIV infekciju.

Nabassaites asiņu iegūšanas procedūra jāveic stingri saskaņā ar medicīniskās bioētikas principiem. Pirms asins savākšanas ir jāsaņem grūtnieces piekrišana tās veikšanai. Iepriekšēju sarunu ar grūtnieci, lai iegūtu informētu piekrišanu visām manipulācijām, sākot no asins nodošanas līdz dokumentācijas aizpildīšanai, veic tikai medicīnas darbinieki. Nekādā gadījumā nav pieļaujams, ka kādu no šīm procedūrām veic personāls ar bioloģisko, ķīmisko, farmaceitisko vai citu nemedicīnisko izglītību, jo tas pārkāpj noteiktās bioētikas normas un cilvēktiesības. Pozitīva HBsAg nēsāšanas testa gadījumā, antivielu klātbūtnes gadījumā pret C hepatīta, HIV infekcijas un sifilisa patogēniem, nabassaites asinis netiek savāktas, un jau savākto asiņu paraugi tiek noraidīti un iznīcināti. Jāatzīmē, ka latentu infekciju nēsāšana jaundzimušajiem ir daudz retāk sastopama nekā pieaugušajiem, tāpēc hematogēna pārneses un infekcijas komplikāciju attīstības varbūtība nabassaites asiņu hematopoētisko šūnu infūzijas laikā ir ievērojami mazāka nekā pieaugušo donoru kaulu smadzeņu izmantošanas gadījumā transplantācijai.

Svarīgs nabassaites asiņu klīniskās izmantošanas aspekts ir transplantācijas novērtēšana, kuras pamatā ir hematopoētisko cilmes šūnu daudzuma noteikšana nabassaites asiņu paraugā un transplantācijai nepieciešamo šūnu devu noteikšana. Pašlaik vēl nav izstrādāti standarti optimālam nabassaites asiņu šūnu daudzumam, kas nepieciešams transplantācijai. Nav vispārpieņemta viedokļa pat par tādiem ikdienas parametriem kā CD34-pozitīvo šūnu skaits un CFU-GM. Daži autori novērtē hematopoētisko šūnu potenciālu, analizējot ilgtermiņa kultūras, nosakot koloniju veidojošo vienību saturu, kas ir kopīgas granulocītiem, eritrocītiem, monocītiem un megakariocītiem - CFU-GEMM.

Tomēr klīniskā vidē nabassaites asiņu transplantācijas standarta novērtēšana parasti ietver tikai kodolu vai mononukleāro šūnu skaita noteikšanu.

Nabassaites asiņu hematopoētisko cilmes šūnu uzglabāšana

Pastāv arī dažas problēmas nabassaites asiņu hematopoētisko šūnu uzglabāšanas tehnoloģijā. Lai sasniegtu optimālu sasaldēšanas režīmu, hematopoētisko cilmes šūnu kriokonservēšanas laikā ir nepieciešams pēc iespējas samazināt nabassaites asiņu daudzumu, kā arī iepriekš izņemt eritrocītus, lai izvairītos no hemolīzes un nesaderības reakcijas riska ar eritrocītu antigēniem (ABO, Rh). Šiem mērķiem ir piemērotas dažādas kodolu šūnu izolēšanas metodes. Pagājušā gadsimta 90. gadu sākumā visplašāk izmantotā metode bija kodolu šūnu izolēšana blīvuma gradientā, kuras pamatā ir Ficoll ar blīvumu 1,077 g/ml vai Percoll ar blīvumu 1,080 g/ml. Nabassaites asiņu atdalīšana blīvuma gradientā ļauj izolēt galvenokārt mononukleārās šūnas, bet noved pie ievērojamiem hematopoētisko cilmes šūnu zudumiem - līdz pat 30-50%.

Hidroksietilcietes sedimentācijas efektivitāte nabassaites asiņu hematopoētisko šūnu izolēšanas procesā tiek vērtēta atšķirīgi. Daži autori norāda uz zemo atdalīšanas kvalitāti, izmantojot šo metodi, savukārt citi pētnieki, gluži pretēji, starp visām iespējamām metodēm dod priekšroku nabassaites asiņu HSC izolēšanai, izmantojot 6% hidroksietilcietes šķīdumu. Vienlaikus tiek uzsvērta augstā hematopoētisko šūnu sedimentācijas efektivitāte, kas, pēc dažiem datiem, sasniedz no 84% līdz 90%.

Cita viedokļa piekritēji uzskata, ka praktiski visas frakcionēšanas metodes ir saistītas ar lieliem kodolu šūnu zudumiem, un ierosina veikt atdalīšanu ar centrifugēšanu, sadalot nabassaites asinis 3 frakcijās: eritrocītos, leikocītu gredzenā un plazmā. Izolējot šūnas šādā veidā, autori atklāja, ka mononukleāro šūnu, agrīno hematopoētisko cilmes šūnu un šūnu ar CD34+ imunofenotipu saturs galu galā sasniedza attiecīgi 90, 88 un 100% no sākotnējā līmeņa. Līdzīgas vērtības ar šo metodi attīrīto nabassaites asiņu šūnu pieaugumam ieguva arī citi pētnieki: pēc sedimentācijas tika izolētas 92% kodolu šūnu, 98% mononukleāro šūnu, 96% CD34-pozitīvo šūnu un 106% koloniju veidojošo vienību.

Deviņdesmito gadu beigās želatīns tika plaši izmantots kā sedimentācijas līdzeklis. Klīniskajā praksē želatīnu hematopoētisko cilmes šūnu izolēšanai no nabassaites asinīm izmanto kopš 1994. gada. Izmantojot 3 % želatīna šķīdumu, kodolu šūnu izolēšanas efektivitāte sasniedz 88–94 %. Želatīna plaša mēroga izmantošana nabassaites asiņu bankas izveidē ir apstiprinājusi tā priekšrocības salīdzinājumā ar citiem sedimentācijas līdzekļiem. Visu iepriekš minēto kodolu šūnu izolēšanas metožu efektivitātes salīdzinošā analīze to secīgas lietošanas apstākļos katrā no testētajiem nabassaites asiņu paraugiem ir pierādījusi, ka 3 % želatīna šķīdums ir optimālais sedimentācijas līdzeklis gan mononukleāro šūnu ar CD34+/CD45+ fenotipu ražas ziņā, gan CFU-GM un CFU-GEMM skaita ziņā. Metodes, kurās izmanto Fikola blīvuma gradientu, kā arī hidroksietilcietes un metilcelulozes izmantošanu, bija ievērojami mazāk efektīvas, hematopoētisko šūnu zudumiem sasniedzot 60 %.

Nabassaites asiņu cilmes šūnu transplantācijas apjomu paplašināšana ir saistīta ne tikai ar to iegūšanas metožu attīstību, bet arī ar uzglabāšanu. Pastāv daudzas problēmas, kas tieši saistītas ar nabassaites asiņu sagatavošanu ilgstošai uzglabāšanai un optimālās tehnoloģijas izvēli to paraugu kriokonservācijai. Starp tām ir jautājumi par atdalīšanas procedūru veikšanas iespējamību, dažādu kriokonservācijas līdzekļu izmantošanu un atkausētu šūnu sagatavošanas transplantācijai metožu pielietošanu. Vietējo nabassaites asiņu paraugu transportēšana bieži tiek veikta no reģioniem, kas atrodas tālu no hematoloģiskajiem centriem. Šajā sakarā rodas problēma par pieņemamiem nabassaites asiņu uzglabāšanas periodiem no to iegūšanas brīža līdz kriokonservācijas sākumam, kas ir īpaši svarīgi, veidojot nabassaites asiņu bankas.

Pētījums par hematopoētisko šūnu funkcionālo aktivitāti nabassaites asinīs pēc ilgstošas uzglabāšanas (līdz 12 gadiem) šķidrā slāpeklī ir parādījis, ka aptuveni 95% hematopoētisko šūnu šajā periodā nezaudē savu augsto proliferācijas spēju. S. Jurasova un līdzautoru darbā (1997) tika pierādīts, ka nabassaites asiņu uzglabāšana istabas temperatūrā (22°C) vai 4°C temperatūrā 24 un 48 stundas būtiski nesamazina hematopoētisko šūnu dzīvotspēju, kas ir attiecīgi 92 un 88% no sākotnējā līmeņa. Tomēr, ja uzglabāšanas periods tiek pagarināts līdz trim dienām, dzīvotspējīgo kodolu šūnu skaits nabassaites asinīs ievērojami samazinās. Tajā pašā laikā citi pētījumi ir parādījuši, ka, uzglabājot 2-3 dienas 22 vai 4°C temperatūrā, pirmām kārtām cieš nobriedušu granulocītu, nevis hematopoētisko šūnu dzīvotspēja.

Nabassaites asiņu hematopoētisko cilmes šūnu dzīvotspēju var negatīvi ietekmēt nabassaites asiņu savākšanas sistēmu komponenti. Dažādu antikoagulantu, kuru darbības mehānisms ir saistīts ar kalcija jonu saistīšanos (ACD, EDTA, XAPD-1), ietekmes uz hematopoētiskajām cilmes šūnām analīze nabassaites asiņu uzglabāšanas apstākļos 24 līdz 72 stundas atklāja to negatīvo ietekmi uz kodoloto šūnu dzīvotspēju. Šajā sakarā autori iesaka izmantot PBS (fosfātu buferšķīdumu) ar dabīgā heparīna pievienošanu bez konservanta 20 U/ml koncentrācijā, kas, viņuprāt, ļauj palielināt nefrakcionētu nabassaites asiņu uzglabāšanas laiku līdz 72 stundām un saglabāt koloniju veidojošo vienību funkcionālo aktivitāti. Tomēr CFU-GM un CFU-G drošības pētījums parādīja, ka nabassaites asiņu uzglabāšanas laiks pirms kriokonservācijas nedrīkst pārsniegt deviņas stundas. Acīmredzot šajā gadījumā jāpiemēro princips, ka pretrunīgu datu gadījumā jāizmanto minimālais ieteicamais nabassaites asiņu uzglabāšanas laiks un pēc iespējas ātrāk jāuzsāk izolēto šūnu programmēta sasaldēšana.

Sasaldējot nabassaites asiņu hematopoētiskās cilmes šūnas, kā krioprotektantu parasti izmanto 10% DMSO šķīdumu. Tomēr papildus izteiktajai krioprotektīvajai iedarbībai dimetilsulfoksīdam šādā koncentrācijā ir arī tieša citotoksiska iedarbība, pat minimāli saskaroties ar nabassaites asiņu hematopoētiskajām šūnām. Lai mazinātu DMSO citotoksisko iedarbību, tiek izmantota nulles iedarbības temperatūra, palielināts visu manipulāciju ātrums un pēc nabassaites asiņu paraugu atkausēšanas tiek veiktas vairākas mazgāšanas.

Kopš 1995. gada Ukrainas Medicīnas zinātņu akadēmijas Hematoloģijas un transfuzioloģijas institūts attīsta zinātnisko virzienu, kura mērķis ir visaptveroša nabassaites asiņu kā alternatīva hematopoētisko cilmes šūnu avota izpēte. Jo īpaši ir izstrādātas jaunas tehnoloģijas nefrakcionētu un frakcionētu nabassaites asiņu hematopoētisko šūnu kriokonservēšanai zemā temperatūrā. Kā krioprotektants tiek izmantots mazmolekulārs medicīniskais polivinilpirolidons. Nefrakcionētu nabassaites asiņu kriokonservēšanas metode ir balstīta uz oriģinālu šūnu iepriekšējas sagatavošanas tehnoloģiju sasaldēšanai un šūnu suspensijas īpašas apstrādes metodi tieši pirms transplantācijas.

Viens no svarīgākajiem faktoriem, kas ietekmē kriokonservētu hematopoētisko cilmes šūnu funkcionālās aktivitātes līmeni, ir šūnu suspensijas atdzesēšanas ātrums, īpaši kristalizācijas fāzē. Programmatūras pieeja sasaldēšanas ātruma un laika problēmas risināšanai sniedz lieliskas iespējas vienkāršu un ļoti efektīvu kriokonservācijas metožu izveidei, nemazgājot šūnu suspensiju no krioprotektoriem pirms transplantācijas.

Šūnu dzīvotspējai to sagatavošanas laikā visbīstamākie posmi ir tiešas sasaldēšanas un atkausēšanas posmi. Saldējot hematopoētiskās šūnas, ievērojama to daļa var tikt iznīcināta starpšūnu vides pārejas brīdī no šķidrās fāzes uz cieto fāzi - kristalizācijā. Lai samazinātu šūnu bojāejas procentuālo daudzumu, tiek izmantoti krioprotektori, kuru darbības mehānismi un krioprotektīvā efektivitāte ir pietiekami aplūkota zinātniskajā literatūrā.

Daudzsološs virziens kaulu smadzeņu un nabassaites asins šūnu kriokonservācijas metožu optimizēšanai ir vairāku krioprotektoru ar dažādiem darbības mehānismiem zemas koncentrācijas apvienojums vienā šķīdumā, piemēram, DMSO, kas darbojas intracelulārā līmenī, un hidroksietilciete vai albumīns, kam ir ekstracelulāra aizsargājoša iedarbība.

Nabassaites asins šūnu kriokonservācijai tradicionāli izmanto 20% DMSO šķīdumu, ko lēnām ielej šūnu suspensijā, nepārtraukti mehāniski maisot ledus vannā, līdz tiek sasniegta vienāda (1:1) krioprotektanta un šūnu suspensijas tilpumu attiecība. Dimetilsulfoksīda galīgā koncentrācija ir 10%. Pēc tam šūnu suspensiju atdzesē programmētā kriogēnā iekārtā ar ātrumu GS/min līdz -40°C, pēc tam dzesēšanas ātrumu palielina līdz 10°C/min. Pēc -100°C sasniegšanas trauku ar šūnu suspensiju ievieto šķidrā slāpeklī (-196°C). Ar šo kriokonservācijas metodi funkcionāli aktīvo mononukleāro šūnu saglabāšanās pēc atkausēšanas sasniedz 85% no sākotnējā līmeņa.

Kriokonservācijas metožu modifikācijas ir vērstas uz DMSO koncentrācijas samazināšanu, pievienojot hidroksietilcieti (dimetilsulfoksīda un hidroksietilcietes galīgās koncentrācijas ir attiecīgi 5 un 6%). Šādas krioprotektoru kombinācijas augsta efektivitāte tiek novērota, sasaldējot mieloīdo šūnu suspensiju, un ar ne mazāku citoprotekciju kā lietojot tikai 10% dimetilsulfoksīda šķīdumu. Dzīvotspējīgo kodolu šūnu skaits sasniedza 96,7% no sākotnējā līmeņa, un to funkcionālā aktivitāte, kas aprēķināta pēc CFU-GM skaita, bija 81,8%.

Lietojot dimetilsulfoksīda šķīdumu koncentrācijā no 5 līdz 10% kombinācijā ar 4% hidroksietilcieti (galīgā koncentrācija), tika konstatēts, ka CD34-pozitīvo šūnu drošība šādos dimetilsulfoksīda diapazonos praktiski nemainās. Tajā pašā laikā, samazinoties dimetilsulfoksīda koncentrācijai no 5 līdz 2,5%, tiek novērota masveida nabassaites asins šūnu bojāeja - dzīvotspējīgo šūnu vienību skaits samazinās no 85,4 līdz 12,2%. Arī citi autori nonāca pie secinājuma, ka tieši 5 un 10% dimetilsulfoksīda šķīdumi (autora versijā - kombinācijā ar autologu serumu) nodrošina maksimālu efektivitāti citoprotekcijā nabassaites asins HSC kriokonservācijas laikā. Turklāt, kombinējot 5 vai 10% dimetilsulfoksīdu ar 4% hidroksietilcietes šķīdumu, tiek atzīmēta augsta secīgi sasaldētu un atkausētu šūnu saglabāšanās, īpaši kontrolētā dzesēšanas ātrumā GS/min. Citā pētījumā tika izmantots krioprotektīvs šķīdums, kas sastāvēja no trim sastāvdaļām - DMSO, attīrīta cilvēka albumīna un RPMI barotnes attiecībā 1:4:5, kas tika pievienots šūnu suspensijai vienādās tilpuma attiecībās (dimetilsulfoksīda galīgā koncentrācija bija 5%). Pēc atkausēšanas ūdens vannā +4 GS temperatūrā CFU-GM saglabāšanās pārsniedza 94%.

Daži autori iesaka kriokonservācijai izmantot nefrakcionētas nabassaites asinis, jo sarkano asinsķermenīšu atdalīšanas procesā tiek zaudēts ievērojams daudzums hematopoētisko šūnu. Šajā variantā mononukleāro šūnu aizsardzībai no kriokristalizācijas kaitīgās ietekmes tiek izmantots 10% dimetilsulfoksīda šķīdums. Saldēšana tiek veikta ar nemainīgu dzesēšanas ātrumu GS/min līdz -80°C, pēc tam nabassaites asins šūnu suspensija tiek pazemināta šķidrā slāpeklī. Šī sasaldēšanas metode izraisa sarkano asinsķermenīšu daļēju līzi, tāpēc asins paraugiem nav nepieciešama frakcionēšana. Pēc atkausēšanas šūnu suspensija tiek mazgāta no brīvā hemoglobīna un dimetilsulfoksīda cilvēka albumīna šķīdumā vai pacienta autologā asins serumā un izmantota transplantācijai.

Hematopoētisko cilmes šūnu saglabāšanās pēc nefrakcionētu nabassaites asiņu atkausēšanas patiešām ir augstāka nekā frakcionētām nabassaites asinīm, tomēr dažu eritrocītu kriostabilitātes dēļ var rasties nopietnas pēctransfūzijas problēmas ABO nesaderīgu eritrocītu pārliešanas dēļ. Turklāt uzglabāto nefrakcionēto asiņu apjoms ievērojami palielinās. No klīniskā viedokļa joprojām ir vēlama iepriekš izolētu un no citām šūnu frakcijām attīrītu nabassaites asiņu hematopoētisko šūnu kriokonservācija.

Jo īpaši ir izstrādāta frakcionētu nabassaites asiņu šūnu kriokonservācijas metode, kas ļauj noņemt eritrocītus sasaldēšanas sagatavošanas stadijā, kurā plazmas aizvietošanas šķīduma "Stabizol" sastāvā tiek izmantots 6% hidroksietilcietes šķīdums. Pēc atkausēšanas šādā veidā iegūtā šūnu suspensija ir gatava klīniskai lietošanai bez papildu manipulācijām.

Tādējādi pašlaik ir daudz diezgan efektīvu nabassaites asiņu kriokonservācijas metožu. To būtiskā atšķirība ir tā, ka asins paraugi tiek sasaldēti nefrakcionēti vai sagatavošanas posmā tiek sadalīti šūnu frakcijās, un tiek sagatavotas kodolotas šūnas bez eritrocītu piejaukuma.

Nabassaites asiņu hematopoētisko cilmes šūnu transplantācija

Astoņdesmito gadu beigās un deviņdesmito gadu sākumā tika konstatēts, ka nabassaites asinīs, kas grūtniecības laikā nodrošina auglim dzīvības uzturēšanu, ir augsts hematopoētisko cilmes šūnu saturs. Nabassaites asins šūnu iegūšanas relatīvā vienkāršība un acīmredzamu ētisku problēmu neesamība veicināja nabassaites asins cilmes šūnu izmantošanu praktiskajā medicīnā. Pirmā veiksmīgā nabassaites asins transplantācija bērnam ar Fankoni anēmiju kalpoja par sākumpunktu nabassaites asins cilmes šūnu transplantāciju apjoma palielināšanai un to banku sistēmas izveidei. Pasaules nabassaites asins banku sistēmā lielākais ir Ņujorkas Placentālās asins centrs, kas atrodas ASV Nacionālā veselības institūta bilancē. Šajā bankā uzglabāto nabassaites asins paraugu skaits tuvojas 20 000. Pieaug arī to recipientu (galvenokārt bērnu) skaits, kuriem veikta veiksmīga transplantācija. Saskaņā ar ASV Veselības departamenta datiem nabassaites asins transplantācijas recipientu pēctransplantācijas periods bez recidīviem jau pārsniedz 10 gadus.

Tas nav pārsteidzoši, jo daudzi nabassaites asiņu hematopoētiskā potenciāla pētījumi liecina, ka agrīnāko cilmes šūnu daudzuma un kvalitātes ziņā tās ne tikai neatpaliek no pieauguša cilvēka kaulu smadzenēm, bet dažos aspektos pat pārsniedz tās. Nabassaites asiņu cilmes šūnu augstāks proliferācijas potenciāls ir saistīts ar šūnu signalizācijas ontoģenētiskajām īpatnībām, specifisku augšanas faktoru receptoru klātbūtni HSC, nabassaites asiņu šūnu spēju autokrīni producēt augšanas faktorus, kā arī telomēru lielo izmēru un garumu.

Tādējādi nabassaites asiņu hematopoētisko cilmes šūnu genomiskās un fenotipiskās īpašības nosaka transplantāta kvalitatīvu iesakņošanos ar augstu donora hematopoēzes atjaunošanas potenciālu recipienta organismā.

Nabassaites asiņu hematopoētisko cilmes šūnu priekšrocības

Starp reālajām nabassaites asiņu hematopoētisko cilmes šūnu izmantošanas priekšrocībām transplantācijai salīdzinājumā ar citiem hematopoētisko šūnu avotiem ir vērts atzīmēt praktiski nulles risku donora veselībai (ja neņemam vērā placentu kā tādu) un vispārējās anestēzijas neesamību. Nabassaites asiņu izmantošana paplašina šūnu transplantācijas iespējas, pateicoties daļēji HLA saderīgām transplantācijām (nesaderība no viena līdz trim antigēniem). Ir izstrādāta metode nabassaites asiņu hematopoētisko šūnu ilgstošai uzglabāšanai sasaldētā stāvoklī, kas palielina retu HLA tipu iegūšanas iespējamību un samazina laiku, kas nepieciešams, lai meklētu HLA saderīgu transplantātu allogēnai transplantācijai. Vienlaikus ievērojami samazinās risks saslimt ar noteiktām latentām infekcijām, kas tiek pārnestas transmisīvā ceļā. Turklāt rodas lēta bioloģiskās dzīvības apdrošināšanas forma, pateicoties iespējai izmantot nabassaites asiņu šūnas autologai transplantācijai.

Tomēr, ņemot vērā nelielo asins daudzumu, ko var savākt no placentas (vidēji ne vairāk kā 100 ml), priekšplānā izvirzās problēma iegūt maksimāli iespējamo asins daudzumu no nabassaites vēnas, vienlaikus stingri ievērojot nosacījumu par minimālu bakteriālas piesārņojuma risku iegūtajos nabassaites asins paraugos.

Nabassaites asiņu primitīvās hematopoētiskās šūnas parasti identificē pēc CD34 glikofosfoproteīna klātbūtnes uz to virsmas, kā arī, pamatojoties uz to funkcionālajām īpašībām, pētot klonogenitāti jeb koloniju veidošanos in vitro. Salīdzinošā analīze parādīja, ka nabassaites asinīs un kaulu smadzenēs maksimālais CD34-pozitīvo šūnu saturs mononukleārajā frakcijā ir attiecīgi 1,6 un 5,0%, maksimālais koloniju veidojošo vienību līmenis CD34+ šūnu subpopulācijā ir 80 un 25%, kopējā CD34+ šūnu klonēšanas efektivitāte ir 88 un 58%, maksimālais koloniju veidojošo šūnu ar augstu proliferācijas potenciālu (HPP-CFC CD34+ populācijā) saturs ir 50 un 6,5%. Jāpiebilst, ka arī CD34+CD38 šūnu klonēšanas efektivitāte un spēja reaģēt uz citokīnu stimulāciju ir augstāka nabassaites asiņu hematopoētiskajās cilmes šūnās.

Fenotipisko antigēnu Thy-1, CD34 un CD45RA kombinācija apstiprina nabassaites asiņu hematopoētisko šūnu augsto proliferācijas potenciālu, un šo trīs antigēnu ekspresija uz nabassaites asiņu šūnu virsmas norāda uz to piederību cilmes šūnām. Turklāt tika atklāts, ka nabassaites asinīs ir šūnas ar CD34+ fenotipu, kurām nav lineāras diferenciācijas marķieru. Šūnu subpopulāciju līmenis ar fenotipisko profilu CD34+/Lin nabassaites asinīs ir aptuveni 1% no kopējā CD34-pozitīvo šūnu skaita. Nabassaites asiņu hematopoētiskās cilmes šūnas rada gan limfoīdo šūnu līniju, gan pluripotento mieloīdo lineārās šūnu diferenciācijas sēriju, kas arī norāda uz to piederību cilmes šūnām.

Kā jau minēts, būtiskas atšķirības starp kaulu smadzenēm un nabassaites asinīm ir transplantācijai izmantoto hematopoētisko šūnu daudzumā, kas iegūts vienas savākšanas procedūras laikā. Ja kaulu smadzeņu transplantācijas laikā šūnu masas zudums atdalīšanas, kriokonservācijas, atkausēšanas un testēšanas laikā ir pieņemams 40–50% robežās, tad nabassaites asinīm šādi šūnu zudumi ir ļoti nozīmīgi, jo, ja tiek izmantots nepietiekams HSC daudzums, transplantācija var izrādīties neefektīva. Saskaņā ar G. Koglera u.c. (1998) datiem, šūnu transplantācijai ar recipienta ķermeņa svaru 10 kg visi nabassaites asiņu paraugi var būt potenciāli transplantāti (kopējais savākto nabassaites asiņu paraugu skaits ir 2098), ar ķermeņa svaru 35 kg - 67%, un tikai 25% paraugu var nodrošināt efektīvu transplantāciju pacientiem ar ķermeņa svaru 50–70 kg. Šī klīniskā situācija norāda uz nepieciešamību optimizēt un uzlabot esošo nabassaites asiņu šūnu savākšanas, reprodukcijas un uzglabāšanas metožu efektivitāti. Tāpēc literatūrā pašlaik plaši tiek apspriesti jautājumi par nabassaites asiņu savākšanas, testēšanas, atdalīšanas un kriokonservēšanas metožu standartizāciju asins banku izveidei, to izmantošanu klīnikā, kā arī noteikti nabassaites asiņu hematopoētisko cilmes šūnu uzglabāšanas nosacījumi un nosacījumi.

[ 7 ], [ 8 ], [ 9 ]

Nabassaites asiņu hematopoētisko cilmes šūnu izmantošana medicīnā

^{Parasti no nabassaites asinīm ir iespējams izdalīt līdz 106} hematopoētiskajām cilmes šūnām, reti vairāk. Šajā sakarā jautājums par to, vai šāds hematopoētisko šūnu daudzums no nabassaites asinīm ir pietiekams, lai atjaunotu hematopoēzi pieaugušam recipientam, joprojām paliek atklāts. Viedokļi šajā jautājumā dalās. Daži pētnieki uzskata, ka šāds daudzums ir pilnīgi pietiekams transplantācijai bērniem, bet pārāk mazs transplantācijai pieaugušajam, kuram optimālais daudzums ir (7-10) x 106 CD34 pozitīvu šūnu ievadīšana ^uz 1 kg ķermeņa masas - vidēji 7 x 108 ^uz vienu transplantāciju. No šiem aprēķiniem izriet, ka viens nabassaites asiņu paraugs satur 700 reizes mazāk hematopoētisko cilmes šūnu nekā nepieciešams vienai transplantācijai pieaugušam pacientam. Tomēr šāds kvantitatīvs novērtējums tiek veikts pēc analoģijas ar pārlieto kaulu smadzeņu šūnu skaitu un nemaz neņem vērā hematopoēzes ontoģenētiskās īpatnības.

Jo īpaši tiek ignorēts fakts, ka nabassaites asiņu hematopoētiskajām cilmes šūnām ir lielāks proliferācijas potenciāls salīdzinājumā ar kaulu smadzeņu hematopoētiskajām cilmes šūnām. In vitro koloniju veidojošā potenciāla pētījumu rezultāti liecina, ka viena nabassaites asiņu deva spēj nodrošināt pieauguša recipienta hematopoēzes atjaunošanos. No otras puses, nedrīkst aizmirst, ka nabassaites asiņu cilmes šūnu skaits samazinās pat embrionālās attīstības laikā: CD34-pozitīvo šūnu saturs nabassaites asinīs lineāri samazinās 5 reizes laika posmā no 20 nedēļām (pētījumam asinis tika iegūtas priekšlaicīgas grūtniecības pārtraukšanas laikā) līdz 40 grūtniecības nedēļām (fizioloģisko dzemdību periods), ko pavada paralēla, pastāvīgi pieaugoša lineāru citodiferenciācijas marķieru ekspresija.

Tā kā trūkst standartizētas pieejas cilmes šūnu kvantitatīvai noteikšanai nabassaites asiņu paraugos, debates par optimālo nabassaites asiņu hematopoētisko cilmes šūnu devu turpinās. Daži pētnieki uzskata, ka kodolīgo šūnu un mononukleāro šūnu skaits, kas pārrēķināts atbilstoši recipienta ķermeņa masai, t. i., to deva, var tikt izmantots kā kritērijs nabassaites asiņu paraugu izvēlei. Daži autori uzskata, ka minimālais CD34+ šūnu kvantitatīvais slieksnis pat HSC autotransplantācijai ir 2 x 106 ^/ kg. Vienlaikus hematopoētisko šūnu devas palielināšana līdz 5 x 106 ^šūnām /kg (tikai 2,5 reizes) jau nodrošina labvēlīgāku agrīnā pēctransplantācijas perioda gaitu, samazina infekcijas komplikāciju biežumu un saīsina profilaktiskās antibiotiku terapijas ilgumu.

Saskaņā ar E. Gluckmana u.c. (1998) datiem, onkohematoloģijā veiksmīgas nabassaites asins šūnu transplantācijas nosacījums ir vismaz 3,7 x 107 kodolu šūnu ievadīšana ^uz 1 kg recipienta ķermeņa masas. Samazinot hematopoētisko cilmes šūnu devu līdz 1 x 107 ^vai mazāk kodolu šūnām uz 1 kg pacienta ķermeņa masas, strauji palielinās transplantācijas neveiksmes un asins vēža recidīva risks. Jāatzīst, ka minimālais cilmes šūnu skaits, kas nepieciešams ātrai hematopoēzes atjaunošanai pēc HSC allotransplantācijas, joprojām nav zināms. Teorētiski to var panākt, izmantojot vienu šūnu, bet kaulu smadzeņu transplantācijas klīniskajā praksē ātru un stabilu transplantācijas procesu garantē vismaz (1-3) x 108 ^kodolu šūnu pārliešana uz 1 kg pacienta ķermeņa masas.

Nesen veiktā detalizētā pētījumā, lai noteiktu optimālo HSC skaitu onkohematoloģijā, tika novēroti pacienti trīs grupās, kas tika iedalītas atkarībā no CD34-pozitīvo šūnu satura transplantētajā materiālā. Pirmās grupas pacientiem tika ievadītas (3-5) x 106 ^šūnas /kg. Otrās grupas pacientiem HSC deva bija (5-10) x 106 ^šūnas /kg, bet trešās grupas pacientiem tika transplantētas šūnas ar vairāk nekā 10 x 106 ^CD34 + šūnām/kg. Vislabākie rezultāti tika novēroti recipientu grupā, kuri saņēma transplantāciju ar CD34-pozitīvo šūnu skaitu, kas vienāds ar (3-5) x 106 ^/ kg. Palielinot transplantēto šūnu devu virs 5 x 106 ^/ kg, statistiski nozīmīgas priekšrocības netika konstatētas. Šajā gadījumā ļoti augsts HSC saturs transplantātā (> 10 x 106 ^/ kg) ir saistīts ar ievērojama skaita atlikušo audzēja šūnu atkārtotu infūziju, kas noved pie slimības recidīva. Tieša saistība starp transplantēto allogēnu cilmes šūnu skaitu un transplantāta pret saimnieka reakcijas attīstību nav noteikta.

Uzkrātā pasaules pieredze nabassaites asiņu transplantācijā apstiprina to augsto repopulācijas potenciālu. Nabassaites asiņu transplantāta iesakņošanās ātrums korelē ar ievadīto kodolu šūnu skaitu. Vislabākie rezultāti tiek novēroti, transplantējot 3 x 107 ^/ kg, savukārt kaulu smadzenēm šī deva ir 2 x 108 ^/ kg. Saskaņā ar koordinējošo centru datiem, 2000. gada beigās visā pasaulē tika veiktas 1200 nabassaites asiņu šūnu transplantācijas, galvenokārt no radniecīgiem donoriem (83%). Ir acīmredzams, ka nabassaites asinis jāapsver kā alternatīva kaulu smadzenēm transplantācijai pacientiem ar hemoblastozi.

Vienlaikus jaundzimušo nabassaites asinsrades audu avota raksturs iedvesmo optimismu, pateicoties tā HSC funkcionālajām iezīmēm. Vienlaikus tikai klīniskā pieredze var atbildēt uz jautājumu par viena nabassaites asiņu parauga pietiekamību, lai atjaunotu hematopoēzi pieaugušam recipientam ar hematopoētisko aplaziju. Nabassaites asiņu šūnu transplantācija tiek izmantota daudzu audzēja un neaudzēja slimību ārstēšanas programmās: leikēmijas un mielodisplastisko sindromu, ne-Hodžkina limfomas un neiroblastomas, aplastiskas anēmijas, iedzimtu Fankoni un Daimonda-Blekfana anēmiju, leikocītu adhēzijas deficīta, Barra sindroma, Guntera slimības, Hērlera sindroma, talasēmijas.

Nabassaites asiņu hematopoētisko šūnu transplantācijas imunoloģiskie aspekti ir pelnījuši rūpīgu uzmanību un atsevišķu pētījumu. Ir pierādīts, ka nabassaites asiņu cilmes šūnu transplantācijas gadījumā no donoriem ar nepilnīgu HLA saderību transplantācijas rezultāti ir diezgan apmierinoši, kas, pēc autoru domām, norāda uz zemāku nabassaites asiņu šūnu imunoreaktivitāti nekā kaulu smadzenēm.

Detalizēts nabassaites asiņu šūnu sastāva pētījums atklāja gan imūnsistēmas efektora šūnu fenotipiskā spektra, gan to funkcionālās aktivitātes iezīmes, kas ļāva uzskatīt nabassaites asinis par HSC avotu ar relatīvi zemu transplantāta pret saimnieka reakcijas attīstības risku. Starp nabassaites asiņu imūnkompetento šūnu funkcionālās nenobrieduma pazīmēm jāatzīmē citokīnu ražošanas nelīdzsvarotība un jutības samazināšanās pret citokīnu imūnās atbildes regulāciju. Iegūtā citotoksisko limfocītu aktivitātes inhibīcija tiek uzskatīta par faktoru, kas veicina imunoloģiskās tolerances veidošanos pret transplantētajiem hematopoētiskajiem audiem. Nabassaites asiņu limfocītu populācijā, atšķirībā no pieaugušo donoru perifērajām asinīm un kaulu smadzenēm, dominē neaktīvi, nenobrieduši limfocīti un supresoru šūnas. Tas norāda uz nabassaites asiņu T-limfocītu samazinātu gatavību imūnreakcijai. Svarīga nabassaites asiņu šūnu monocītu populācijas iezīme ir zems funkcionāli pilnvērtīgu un aktīvu antigēnus prezentējošu šūnu saturs.

No vienas puses, imūnsistēmas efektora šūnu zemais brieduma līmenis nabassaites asinīs paplašina to lietošanas indikācijas klīnikā, jo šīs īpašības nodrošina imūnkonflikta intensitātes samazināšanos starp donora un recipienta šūnām. Bet, no otras puses, ir zināms par korelācijas esamību starp "transplantāta pret saimnieka" reakcijas attīstības pakāpi un transplantācijas pretvēža efektu, tas ir, "transplantāta pret leikēmiju" efekta attīstību. Šajā sakarā tika veikts pētījums par nabassaites asins šūnu pretvēža citotoksicitāti. Iegūtie rezultāti liecina, ka, neskatoties uz imūnkompetento nabassaites asins šūnu patiesi novājinātu reakciju uz antigēna stimulāciju, galvenokārt aktivizētie limfocīti ir dabiskie killeri un killerveida šūnas, kas aktīvi piedalās pretvēža citotoksicitātes īstenošanas mehānismos. Turklāt nabassaites asinīs tika atrastas limfocītu apakšpopulācijas ar CD16+CD56+ un CD16"TCRa/p+ fenotipiem. Tiek pieņemts, ka šīs šūnas aktivizētajā formā īsteno "transplantāta pret leikēmiju" reakciju.

Ukrainas Medicīnas zinātņu akadēmijas Onkoloģijas institūtā vēža pacientiem ar pastāvīgu hematopoētisko hipoplāziju, ko izraisījusi ķīmijterapija un staru terapija, tika ievadītas kriokonservētas nabassaites asiņu hematopoētiskās šūnas. Šādiem pacientiem nabassaites asiņu hematopoētisko cilmes šūnu transplantācija diezgan efektīvi atjaunoja nomāktu hematopoēzi, par ko liecina pastāvīgs nobriedušu veidotu elementu satura pieaugums perifērajās asinīs, kā arī šūnu un humorālās imunitātes stāvokli raksturojošo rādītāju pieaugums. Nabassaites asiņu hematopoētisko šūnu transplantācijas repopulācijas efekta stabilitāte ļauj turpināt staru terapiju un ķīmijterapiju, nepārtraucot ārstēšanas kursu. Ir informācija par nabassaites asiņu cilmes šūnu allotransplantācijas augstāku efektivitāti onkohematoloģiskiem pacientiem: audzēja slimības recidīva risks, to lietojot, bija 25% salīdzinājumā ar 40% pacientiem ar transplantētām allogēnām kaulu smadzenēm.

Kriokonservētu nabassaites asiņu cilmes šūnu darbības mehānisms jāuzskata par recipienta hematopoēzes humorālās stimulācijas rezultātu, ko izraisa jaundzimušo šūnu unikālā spēja autokrīni producēt hematopoētiskos augšanas faktorus, kā arī par donoru šūnu īslaicīgas iesakņošanās sekām (ko apliecina ticams augļa hemoglobīna satura pieaugums recipientu perifērajās asinīs 7.–15. dienā pēc transfūzijas, salīdzinot ar sākotnējiem datiem). Pēctransfūzijas reakciju neesamība nabassaites asiņu recipientiem ir to imūnkompetento šūnu relatīvās tolerances rezultāts, kā arī kriokonservētā materiāla bioloģiskās atbilstības ticamības kritērijs.

Nabassaites asiņu T-limfocītu killer cilmes šūnas spēj aktivizēties eksogēnu citokīnu stimulācijas ietekmē, ko izmanto, lai izstrādātu jaunas ex vivo un in vivo metodes transplantātu limfoīdo elementu pretvēža citotoksicitātes izraisīšanai turpmākai imunoterapijai. Turklāt nabassaites asiņu imūnkompetento šūnu genoma "nenobriedums" ļauj tās izmantot pretvēža aktivitātes pastiprināšanai, izmantojot molekulārās modelēšanas metodes.

Mūsdienās nabassaites asinis ir plaši pielietotas galvenokārt bērnu hematoloģijā. Bērniem ar akūtu leikēmiju nabassaites asiņu hematopoētisko cilmes šūnu allotransplantācija, salīdzinot ar kaulu smadzeņu allotransplantāciju, ievērojami samazina transplantāta reakcijas pret saimnieku sastopamību. Tomēr tam pievienojas ilgāks neitro- un trombocitopēnijas periods un, diemžēl, augstāks 100 dienu pēctransplantācijas mirstības rādītājs. Ilgāks granulocītu un trombocītu līmeņa atjaunošanās periods perifērajās asinīs var būt saistīts ar nepietiekamu CD34 pozitīvu nabassaites asiņu šūnu apakšpopulāciju diferenciāciju, ko apliecina zems radioaktīvā rodamīna absorbcijas līmenis un zema CD38 antigēnu ekspresija uz to virsmas.

Tajā pašā laikā nabassaites asiņu hematopoētisko cilmes šūnu transplantācija pieaugušiem pacientiem, kas tika veikta gan saderīga nesaistīta kaulu smadzeņu donora trūkuma, gan autologu HSC mobilizācijas iespējas dēļ, pacientu grupā līdz 30 gadu vecumam (73%) uzrādīja augstu viena gada dzīvildzi bez recidīva. Paplašinot saņēmēju vecuma diapazonu (18–46 gadi), izdzīvošanas rādītājs samazinājās līdz 53%.

Šūnu ar CD34+ fenotipu kvantitatīvā analīze kaulu smadzenēs un nabassaites asinīs atklāja to augstāku (3,5 reizes) saturu kaulu smadzenēs, bet nabassaites asinīs tika novērota ievērojama šūnu ar fenotipisko profilu CD34+HLA-DR pārsvars. Ir zināms, ka asins šūnas ar imunoloģiskajiem marķieriem CD34+HLA-DR proliferējas aktīvāk nekā šūnas ar imunofenotipu CD34+HLA-DR+, kas tika apstiprināts eksperimentālos pētījumos par ilgtermiņa hematopoētisko šūnu kultūras augšanu in vitro. Primitīvo šūnu prekursori ar CD34+CD38 fenotipu ir atrodami gan nabassaites asinīs, gan kaulu smadzenēs, bet nabassaites asins šūnām ar marķieru komplektu CD34+CD38 ir augstāka klonogēnā aktivitāte nekā tāda paša fenotipa hematopoētiskajām šūnām, kas izolētas no pieaugušo donoru kaulu smadzenēm. Turklāt nabassaites asins šūnas ar CD34+CD38 imunofenotipu proliferējas ātrāk, reaģējot uz citokīnu stimulāciju (IL-3, IL-6, G-CSF), un ilgtermiņa kultūrās veido 7 reizes vairāk koloniju nekā kaulu smadzeņu šūnas.

Nabassaites asiņu cilmes šūnu bankas

Lai pareizi attīstītu jaunu praktiskās medicīnas jomu - nabassaites asiņu cilmes šūnu transplantāciju, kā arī lai ieviestu kaulu smadzeņu hematopoētisko cilmes šūnu transplantāciju, ir nepieciešams plašs asins banku tīkls, kas jau ir izveidots ASV un Eiropā. Vietējos nabassaites asiņu banku tīklus apvieno Netcord Bank Association. Starptautiskas nabassaites asiņu banku asociācijas izveides lietderību nosaka fakts, ka nesaistītu transplantāciju veikšanai ir nepieciešams liels skaits tipizētu nabassaites asiņu paraugu, kas ļauj izvēlēties HLA identisku donoru. Tikai banku sistēmas izveide ar dažādu HLA tipu asins paraugu glabāšanu var reāli atrisināt nepieciešamā donora atrašanas problēmu. Šādas nabassaites asiņu bankas sistēmas organizēšanai ir nepieciešama iepriekšēja ētikas un tiesību normu izstrāde, kas pašlaik tiek apspriestas starptautiskā līmenī.

Lai Ukrainā izveidotu nabassaites asiņu bankas, ir jāizstrādā vesela virkne noteikumu un dokumentu.

Pirmkārt, tie ir nabassaites asiņu savākšanas, frakcionēšanas un sasaldēšanas metožu standartizācijas jautājumi. Ir nepieciešams regulēt nabassaites asiņu savākšanas noteikumus dzemdību namos atbilstoši medicīniskās ētikas prasībām, noteikt minimālo nabassaites asiņu daudzumu, kas nodrošina veiksmīgu transplantāciju. Ir nepieciešams salīdzināt un standartizēt dažādus kritērijus hematopoētisko cilmes šūnu kvalitātes un daudzuma novērtēšanai, kā arī HLA tipizēšanas metodes un diagnostikas metodes ģenētiskām un infekcijas slimībām, kas var tikt pārnestas nabassaites asiņu šūnu infūzijas laikā, lai noteiktu vienotus kritērijus veselīgu donoru atlasei. Ir vērts apspriest arī jautājumus par atsevišķu uzglabāšanas vietu izveidi no nabassaites asinīm iegūtajam serumam, šūnām un DNS.

Ir absolūti nepieciešams organizēt nabassaites asiņu datu datoru tīklu, lai to savienotu ar kaulu smadzeņu donoru reģistriem. Šūnu transplantoloģijas tālākai attīstībai nepieciešams izstrādāt īpašus protokolus nabassaites asiņu un kaulu smadzeņu transplantācijas rezultātu salīdzināšanai no HLA identiskiem radiniekiem un nesaistītiem donoriem. Dokumentācijas standartizācija, tostarp vecāku informēta piekrišana, kā arī mātes vai radinieku informēšana par bērnam atklātajām ģenētiskajām un/vai infekcijas slimībām, var palīdzēt atrisināt ētiskās un juridiskās problēmas, kas saistītas ar nabassaites asiņu šūnu klīnisko izmantošanu.

Noteicošais nosacījums šūnu transplantoloģijas attīstībai Ukrainā būs Nacionālās cilmes šūnu donoru programmas pieņemšana un starptautiskās sadarbības attīstīšana ar citām valstīm, izmantojot Pasaules smadzeņu donoru asociāciju (WMDA), ASV Nacionālo smadzeņu donoru programmu (NMDP) un citus reģistrus.

Apkopojot joprojām īso nabassaites asiņu hematopoētisko cilmes šūnu transplantācijas attīstības vēsturi, atzīmējam, ka pirmie pieņēmumi par nabassaites asiņu izmantošanas iespējām klīnikā, kas tika izteikti jau 70. gadu sākumā, 80. gados tika apstiprināti ar eksperimentālu pētījumu rezultātiem ar dzīvniekiem, un 1988. gadā tika veikta pasaulē pirmā nabassaites asiņu hematopoētisko šūnu transplantācija cilvēkam, pēc kuras sāka veidot globālu nabassaites asiņu banku tīklu. 10 gadu laikā pacientu skaits ar transplantētām nabassaites asiņu hematopoētiskajām šūnām tuvojās 800. Starp tiem bija pacienti ar dažādām audzēja (leikēmija, limfoma, cietie audzēji) un neaudzēja (iedzimti imūndeficīti, anēmija, slimības, kas saistītas ar vielmaiņas traucējumiem) rakstura slimībām.

Nabassaites asinīs agrīno un iesaistīto šūnu prekursoru saturs ir augstāks nekā pieauguša cilvēka perifērajās asinīs. Granulocītu-makrofāgu koloniju veidojošo vienību skaita un to proliferācijas potenciāla ziņā nabassaites asinis ievērojami pārsniedz pieaugušo perifērās asinis pat pēc augšanas faktoru ieviešanas. Ilgstošas šūnu kultūrās in vitro ir novērota lielāka nabassaites asiņu šūnu proliferatīvā aktivitāte un dzīvotspēja nekā kaulu smadzeņu šūnām. Nabassaites asiņu cilmes šūnu transplantācijas kritiskie momenti ir kodolu šūnu skaits un hematopoētiskais potenciāls, citomegalovīrusa infekcijas klātbūtne, donora un recipienta HLA saderība, pacienta ķermeņa masa un vecums.

Tomēr nabassaites asiņu cilmes šūnu transplantācija būtu jāapsver kā alternatīva kaulu smadzeņu transplantācijai smagu asins slimību ārstēšanā, galvenokārt bērniem. Nabassaites asiņu šūnu transplantācijas klīniskās problēmas pakāpeniski tiek risinātas - jau ir diezgan efektīvas metodes nabassaites asiņu šūnu savākšanai, atdalīšanai un kriokonservēšanai, tiek nodrošināti apstākļi nabassaites asiņu banku veidošanai, un tiek uzlabotas metodes kodolu šūnu testēšanai. Veidojot bankas, liela mēroga nabassaites asiņu hematopoētisko cilmes šūnu ieguves laikā optimāli būtu atdalīšanai izmantot 3% želatīna šķīdumu un 6% hidroksietilcietes šķīdumu.

P. Perehrestenko un līdzautori (2001) pamatoti norāda, ka nabassaites asiņu cilmes šūnu transplantācijai ir jāieņem sava pienācīgā vieta terapeitisko pasākumu kompleksā, lai pārvarētu dažādas ģenēzes hematopoētiskās depresijas, jo nabassaites asiņu cilmes šūnām ir vairākas būtiskas priekšrocības, starp kurām vissvarīgākās ir to iegūšanas relatīvā vienkāršība, riska neesamība donoram, zema jaundzimušo šūnu piesārņošana ar vīrusiem un salīdzinoši zemās transplantācijas izmaksas. Daži autori norāda, ka nabassaites asiņu šūnu transplantācija retāk notiek ar transplantāta pret saimnieka reakciju saistītām komplikācijām nekā kaulu smadzeņu šūnu transplantācija, kas, viņuprāt, ir saistīts ar vāju HLA-DR antigēnu ekspresiju uz nabassaites asiņu šūnām un to nenobriedušumu. Tomēr galvenā kodolu šūnu populācija nabassaites asinīs ir T limfocīti (CD3-pozitīvas šūnas), kuru saturs ir aptuveni 50%, kas ir par 20% mazāk nekā pieauguša cilvēka perifērajās asinīs, taču fenotipiskās atšķirības T šūnu apakšpopulācijās no šiem avotiem ir nenozīmīgas.

Starp faktoriem, kas tieši ietekmē izdzīvošanas rādītājus nabassaites asiņu cilmes šūnu transplantācijas gadījumā, jāatzīmē pacientu vecums (vislabākie rezultāti tiek novēroti recipientiem vecumā no viena līdz pieciem gadiem), slimības agrīna diagnostika un leikēmijas forma (efektivitāte ir ievērojami augstāka akūtas leikēmijas gadījumā). Liela nozīme ir kodolīgo nabassaites asiņu šūnu devai, kā arī to HLA saderībai ar recipientu. Nav nejaušība, ka nabassaites asiņu HSC transplantācijas klīniskās efektivitātes analīze onkohematoloģijā uzrāda labākos ārstēšanas rezultātus, izmantojot radniecīgas transplantācijas: viena gada dzīvildze bez recidīva šajā gadījumā sasniedz 63%, savukārt ar nesaistītu transplantāciju - tikai 29%.

Tādējādi liels skaits cilmes šūnu nabassaites asinīs un jaundzimušo hematopoētisko cilmes šūnu augstā repopulācijas spēja ļauj tās izmantot allogēnai transplantācijai onkohematoloģiskiem pacientiem. Tomēr jāatzīmē, ka hematopoēzes atjaunošanās pēc nabassaites asiņu hematopoētisko šūnu transplantācijas ir "laikā ieilgusi": neitrofilo leikocītu satura atjaunošanās perifērajās asinīs parasti tiek novērota līdz 6. nedēļas beigām, un trombocitopēnija parasti izzūd pēc 6 mēnešiem. Turklāt nabassaites asiņu hematopoētisko šūnu nenobriedums neizslēdz imunoloģiskus konfliktus: smaga akūta un hroniska transplantāta pret saimnieka slimība tiek novērota attiecīgi 23% un 25% recipientu. Akūtas leikēmijas recidīvi līdz pirmā gada beigām pēc nabassaites asiņu transplantācijas tiek novēroti 26% gadījumu.

[ 10 ], [ 11 ]