Šūnu transplantācijas ierobežojumi, draudi un komplikācijas

Reģeneratīvā plastiskā medicīna balstās uz embrionālo un cilmes šūnu toti- un pluripotento īpašību klīnisku ieviešanu, kas ļauj in vitro un in vivo izveidot noteiktas šūnu līnijas, kas atjauno slima cilvēka bojātos audus un orgānus.

Reāla iespēja izmantot cilvēka embrionālās cilmes šūnas un no cilvēka iegūto definitīvo audu iegūtās cilmes šūnas (tā sauktās "pieaugušo" cilmes šūnas) terapeitiskiem mērķiem vairs nav apšaubāma. Tomēr ASV Nacionālās un Medicīnas akadēmiju (Cilmes šūnas un nākotnes reģeneratīvā medicīna, National Academy Press) un ASV Nacionālā veselības institūta (Cilmes šūnas un nākotnes pētījumu virzieni, Nat. Inst, of Health USA) eksperti iesaka veikt detalizētāku cilmes šūnu īpašību izpēti eksperimentos ar atbilstošiem bioloģiskiem modeļiem un objektīvi novērtēt visas transplantācijas sekas, un tikai pēc tam izmantot cilmes šūnas klīnikā.

Ir noskaidrots, ka cilmes šūnas ir daļa no visu trīs dīgļslāņu audu atvasinājumiem. Cilmes šūnas ir atrodamas tīklenē, radzenē, ādas epidermā, kaulu smadzenēs un perifērajās asinīs, asinsvados, zobu pulpā, nierēs, kuņģa-zarnu trakta epitēlijā, aizkuņģa dziedzerī un aknās. Izmantojot modernas metodes, ir pierādīts, ka neironu cilmes šūnas ir lokalizētas pieauguša cilvēka smadzenēs un muguras smadzenēs. Šie sensacionālie dati piesaistīja īpašu zinātnieku un plašsaziņas līdzekļu uzmanību, jo neironi smadzenēs kalpoja kā klasisks statiskas šūnu populācijas piemērs, kas netiek atjaunota. Gan ontoģenēzes agrīnajā, gan vēlīnā periodā neironu, astrocīti un oligodendrocīti veidojas dzīvnieku un cilvēku smadzenēs, pateicoties neironu cilmes šūnām (Cilmes šūnas: zinātnes progress un nākotnes pētījumu virzieni. Nat. Inst, of Health USA).

Tomēr normālos apstākļos definitīvo audu cilmes šūnu plastiskums neizpaužas. Lai realizētu definitīvo audu cilmes šūnu plastisko potenciālu, tās ir jāizolē un pēc tam jākultivē vidē ar citokīniem (LIF, EGF, FGF). Turklāt cilmes šūnu atvasinājumi veiksmīgi iesakņojas tikai tad, ja tos transplantē dzīvnieka organismā ar nomāktu imūnsistēmu (γ-starojums, citostatiķi, busulfāns utt.). Līdz šim nav iegūti pārliecinoši pierādījumi par cilmes šūnu plastiskuma ieviešanu dzīvniekiem, kas nav bijuši pakļauti starojumam vai citiem efektiem, kas izraisa dziļu imūnsupresiju.

Šādos apstākļos ESŠ bīstamais potenciāls izpaužas, pirmkārt, to transplantācijas laikā ārpusdzemdes zonās - subkutānas ESŠ injekcijas laikā imūndeficīta pelēm injekcijas vietā veidojas teratokarcinomas. Turklāt cilvēka embrija attīstības laikā hromosomu anomāliju biežums ir augstāks nekā embrioģenēzē dzīvniekiem. Blastocistas stadijā tikai 20-25% cilvēka embriju sastāv no šūnām ar normālu kariotipu, un lielākā daļa agrīno cilvēka embriju, kas iegūti pēc apaugļošanas in vitro, uzrāda haotisku hromosomu mozaīku un ļoti bieži saskaras ar skaitliskām un strukturālām aberācijām.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]

Cilmes šūnu labvēlīgā ietekme

Klīnisko pētījumu sākotnējie rezultāti apstiprina cilmes šūnu labvēlīgo ietekmi uz pacientu, taču joprojām nav informācijas par šūnu transplantācijas ilgtermiņa ietekmi. Sākotnēji literatūrā dominēja ziņojumi par pozitīviem embrionālo smadzeņu fragmentu transplantācijas rezultātiem Parkinsona slimības gadījumā, taču pēc tam sāka parādīties dati, kas noliedz pacientu smadzenēs transplantētu embrionālo vai augļa nervu audu efektīvo terapeitisko efektu.

20. gadsimta vidū pirmo reizi tika atklāta hematopoēzes atjaunošana dzīvniekiem, kas letāli apstaroti pēc kaulu smadzeņu šūnu intravenozas transfūzijas, un 1969. gadā amerikāņu pētnieks D. Tomass veica pirmo kaulu smadzeņu transplantāciju cilvēkam. Toreizējais zināšanu trūkums par donora un recipienta kaulu smadzeņu šūnu imunoloģiskās nesaderības mehānismiem noveda pie augstas mirstības biežas transplantācijas neveiksmes un transplantāta pret saimnieka reakcijas attīstības dēļ. Galvenā histokompatibilitātes kompleksa, kas ietver cilvēka leikocītu antigēnus (HbA), atklāšana un to tipizēšanas metožu uzlabošana ļāva ievērojami palielināt izdzīvošanu pēc kaulu smadzeņu transplantācijas, kas noveda pie šīs ārstēšanas metodes plašas izmantošanas onkohematoloģijā. Desmit gadus vēlāk tika veiktas pirmās hematopoētisko cilmes šūnu (HSC) transplantācijas, kas iegūtas no perifērajām asinīm, izmantojot leikoferēzi. 1988. gadā nabassaites asinis pirmo reizi tika izmantotas kā HSC avots Francijā, lai ārstētu bērnu ar Fankoni anēmiju, un kopš 2000. gada beigām presē parādās ziņojumi par HSC spēju diferencēties dažādu audu tipu šūnās, kas potenciāli paplašina to klīniskā pielietojuma jomu. Tomēr izrādījās, ka transplantācijas materiāls kopā ar HSC satur ievērojamu skaitu dažādu dabu un īpašību nehematopoētisku šūnu piemaisījumu. Šajā sakarā tiek izstrādātas transplantāta attīrīšanas metodes un kritēriji tā šūnu tīrības novērtēšanai. Jo īpaši tiek izmantota CD34+ šūnu pozitīva imūnselekcija, kas ļauj izolēt HSC, izmantojot monoklonālās antivielas.

[ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ], [ 12 ]

Cilmes šūnu terapijas komplikācijas

Kaulu smadzeņu transplantācijas komplikācijas visbiežāk ir hematoloģiskas un saistītas ar ilgstošu jatrogēnu pancitopēniju. Visbiežāk attīstās infekcijas komplikācijas, anēmija un asiņošana. Šajā sakarā ir ārkārtīgi svarīgi izvēlēties optimālo kaulu smadzeņu savākšanas, apstrādes un uzglabāšanas veidu, lai maksimāli saglabātu cilmes šūnas, kas nodrošinās ātru un stabilu hematopoēzes atjaunošanos. Raksturojot transplantātu, pašlaik parasti tiek vērtēti šādi parametri: mononukleāro un/vai kodolu šūnu skaits, koloniju veidojošās vienības un CD34-pozitīvo šūnu saturs. Diemžēl šie rādītāji sniedz tikai netiešu novērtējumu par transplantāta cilmes šūnu populācijas reālo hematopoētisko spēju. Mūsdienās nav absolūti precīzu parametru, lai noteiktu transplantāta pietiekamību ilgstošai hematopoēzes atjaunošanai pacientiem, pat ar autologu kaulu smadzeņu transplantāciju. Vispārīgu kritēriju izstrāde ir ārkārtīgi sarežģīta, jo trūkst stingru standartu transplantāta apstrādei, kriokonservācijai un testēšanai. Turklāt ir jāņem vērā viss faktoru klāsts, kas ietekmē veiksmīgas hematopoēzes atjaunošanas parametrus katram pacientam individuāli. Autologā kaulu smadzeņu transplantācijā vissvarīgākie no tiem ir iepriekšējo ķīmijterapijas kursu skaits, kondicionēšanas režīma raksturojums, slimības periods, kurā kaulu smadzenes tika savāktas, un koloniju stimulējošo faktoru lietošanas shēmas pēctransplantācijas periodā. Turklāt nedrīkst aizmirst, ka ķīmijterapija pirms transplantācijas savākšanas var negatīvi ietekmēt kaulu smadzeņu cilmes šūnas.

Alogēnas kaulu smadzeņu transplantācijas laikā ievērojami palielinās smagu toksisku komplikāciju biežums. Šajā sakarā interesanti ir statistikas dati par allogēnu kaulu smadzeņu transplantāciju talasēmijas gadījumā. Eiropas Kaulu smadzeņu transplantācijas grupas ziņojumos ir reģistrētas aptuveni 800 kaulu smadzeņu transplantācijas pacientiem ar lielo talasēmiju. Alogēnā transplantācija talasēmijas gadījumā lielākajā daļā gadījumu tiek veikta no HLA identiskiem brāļiem un māsām, kas ir saistīta ar smagām komplikācijām un augstu mirstību cilmes šūnu materiāla transplantācijas laikā no daļēji saderīgiem radniecīgiem vai saderīgiem nesaistītiem donoriem. Lai samazinātu letālu infekcijas komplikāciju risku, pacienti tiek ievietoti izolētās aseptiskās kastēs ar lamināru gaisa plūsmu un saņem diētu ar zemu baktēriju vai abakteriālu saturu. Zarnu bakteriālai dekontaminācijai per os tiek izrakstītas neabsorbējamas antibiotiku un pretsēnīšu zāļu formas. Profilakses nolūkos amfotericīnu B ievada intravenozi. Sistēmisku infekciju profilaksi pastiprina amikacīns un ceftazidīms, kas tiek izrakstīti dienu pirms transplantācijas, turpinot ārstēšanu līdz pacienta izrakstīšanai. Visi asins produkti pirms transfūzijas tiek apstaroti ar 30 Gy devu. Parenterāla barošana transplantācijas laikā ir nepieciešams nosacījums un sākas tūlīt pēc pārtikas uzņemšanas ierobežošanas dabiskā veidā.

Ar imūnsupresīvo zāļu augsto toksicitāti ir saistītas vairākas komplikācijas, kas bieži izraisa sliktu dūšu, vemšanu un mukozītu, nieru bojājumus un intersticiālu pneimoniju. Viena no smagākajām ķīmijterapijas komplikācijām ir aknu vēnu nosprostošanās, kas izraisa nāvi agrīnā pēctransplantācijas periodā. Aknu portālās sistēmas vēnu trombozes riska faktori ir pacientu vecums, hepatīta un aknu fibrozes klātbūtne, kā arī imūnsupresīvā terapija pēc kaulu smadzeņu transplantācijas. Venozu nosprostošanās ir īpaši bīstama talasēmijas gadījumā, ko pavada aknu hemosideroze, hepatīts un fibroze - bieži transfūzijas terapijas pavadoņi. Aknu portālās sistēmas vēnu tromboze attīstās 1-2 nedēļas pēc transplantācijas un tai raksturīga strauja bilirubīna un transamināžu aktivitātes palielināšanās asinīs, hepatomegālijas progresēšana, ascīts, encefalopātija un sāpes vēdera augšdaļā. Histoloģiski autopsijas materiālā atklājas endotēlija bojājumi, subendoteliālas asiņošanas, centrilobulāro hepatocītu bojājumi, trombotiska venulu un aknu centrālo vēnu nosprostojums. Pacientiem ar talasēmiju ir aprakstīti letālas sirdsdarbības apstāšanās gadījumi, kas saistīti ar citostatisko līdzekļu toksisko iedarbību.

Pirms transplantācijas periodā ciklofosfamīds un busulfāns bieži izraisa toksiski hemorāģisku cistītu ar patoloģiskām izmaiņām uroepitēlija šūnās. Ciklosporīna A lietošana kaulu smadzeņu transplantācijā bieži vien ir saistīta ar nefro- un neirotoksicitāti, hipertensijas sindromu, šķidruma aizturi organismā un hepatocītu citolīzi. Seksuālā un reproduktīvā disfunkcija biežāk novērojama sievietēm. Maziem bērniem pubertātes attīstība pēc transplantācijas parasti netiek ietekmēta, bet vecākiem bērniem seksuālās sfēras attīstības patoloģija var būt ļoti nopietna - līdz pat sterilitātei. Ar pašu transplantāciju tieši saistītas komplikācijas ir alogēnu kaulu smadzeņu šūnu atgrūšana, ABO nesaderība, akūtas un hroniskas transplantāta pret saimnieka slimības formas.

Pacientiem pēc ABO nesaderīgas kaulu smadzeņu transplantācijas saimnieka un ABO donora izoaglutinīni tiek ražoti 330–605 dienas pēc transplantācijas, kas var izraisīt ilgstošu hemolīzi un ievērojami palielināt nepieciešamību pēc asins pārliešanas. Šo komplikāciju novērš, pārliejot tikai 0. tipa eritrocītus. Pēc transplantācijas dažiem pacientiem rodas autoimūna neitropēnija, trombocitopēnija vai pancitopēnija, kuras korekcijai nepieciešama splenektomija.

35–40 % recipientu akūta transplantāta reakcija pret saimnieka slimību attīstās 100 dienu laikā pēc allogēnas HLA identiskas kaulu smadzeņu transplantācijas. Ādas, aknu un zarnu iesaistes pakāpe variē no izsitumiem, caurejas un mērenas hiperbilirubinēmijas līdz ādas lobīšanai, zarnu nosprostojumam un akūtai aknu mazspējai. Pacientiem ar talasēmiju I pakāpes akūtas transplantāta reakcijas sastopamība pēc kaulu smadzeņu transplantācijas ir 75 %, bet II un augstākas pakāpes — 11–53 %. Hroniska transplantāta reakcija pret saimnieka slimību kā sistēmisks vairāku orgānu sindroms parasti attīstās 100–500 dienu laikā pēc allogēnas kaulu smadzeņu transplantācijas 30–50 % pacientu. Tiek skarta āda, mutes dobums, aknas, acis, barības vads un augšējie elpceļi. Izšķir ierobežotu hroniskas transplantāta reakcijas formu, kad tiek skarta āda un/vai aknas, un plaši izplatītu formu, kad ģeneralizēti ādas bojājumi tiek kombinēti ar hronisku agresīvu hepatītu, acu, siekalu dziedzeru vai jebkura cita orgāna bojājumiem. Nāvi bieži izraisa infekcijas komplikācijas, kas rodas smaga imūndeficīta rezultātā. Talasēmijas gadījumā viegla hroniska transplantāta atgrūšanas slimības forma rodas 12% gadījumu, vidēji smaga forma - 3% gadījumu un smaga forma - 0,9% pacientu, kuriem pārstādītas allogēnas HLA saderīgas kaulu smadzenes. Smaga kaulu smadzeņu transplantācijas komplikācija ir transplantāta atgrūšana, kas attīstās 50-130 dienas pēc operācijas. Grūtniecības biežums ir atkarīgs no kondicionēšanas režīma. Jo īpaši pacientiem ar talasēmiju, kuri sagatavošanās periodā saņēma tikai metotreksātu, kaulu smadzeņu transplantāta atgrūšana tika novērota 26% gadījumu, metotreksāta kombinācijā ar ciklosporīnu A - 9% gadījumu un tikai ciklosporīna A ievadīšanas gadījumā - 8% gadījumu (Gaziev et al., 1995).

Infekcijas komplikācijas pēc kaulu smadzeņu transplantācijas izraisa vīrusi, baktērijas un sēnītes. To attīstība ir saistīta ar dziļu neitropēniju, ko izraisa ķīmijterapijas zāles kondicionēšanas periodā, gļotādas barjeru bojājumiem ar citostatiskiem līdzekļiem un transplantāta reakcijas pret saimnieku. Atkarībā no attīstības laika izšķir trīs infekcijas komplikāciju fāzes. Pirmajā fāzē (attīstās pirmajā mēnesī pēc transplantācijas) dominē gļotādas barjeru bojājumi un neitropēnija, ko bieži pavada vīrusu infekcijas (herpes, Epšteina-Barra vīruss, citomegalovīruss, Varicella zoster), kā arī infekcijas, ko izraisa grampozitīvas un gramnegatīvas baktērijas, Candida sēnītes, aspergilli. Agrīnā pēctransplantācijas periodā (otrajā un trešajā mēnesī pēc transplantācijas) vissmagākā infekcija ir citomegalovīruss, kas bieži noved pie pacientu nāves infekcijas komplikāciju otrajā fāzē. Talasēmijas gadījumā citomegalovīrusa infekcija pēc kaulu smadzeņu transplantācijas attīstās 1,7–4,4% recipientu. Trešā fāze tiek novērota vēlīnā pēctransplantācijas periodā (trīs mēnešus pēc operācijas), un tai raksturīga smaga kombinēta imūndeficīta forma. Šajā periodā bieži sastopamas infekcijas, ko izraisa Varicella zoster, streptokoki, Pneumocystis carinii, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae un hepatotropiskie vīrusi. Talasēmijas gadījumā pacientu mirstība pēc kaulu smadzeņu transplantācijas ir saistīta ar bakteriālu un sēnīšu sepsi, idiopātisku intersticiālu un citomegalovīrusa pneimoniju, akūtu respiratorā distresa sindromu, akūtu sirds mazspēju, sirds tamponādi, smadzeņu asiņošanu, vēnu nosprostojošu aknu slimību un akūtu transplantāta atgrūšanas slimību.

Pašlaik ir gūti zināmi panākumi metožu izstrādē tīru hematopoētisko cilmes šūnu populāciju izolēšanai no kaulu smadzenēm. Ir uzlabota augļa asiņu iegūšanas tehnika no nabassaites, un ir izveidotas metodes hematopoētisko šūnu izolēšanai no nabassaites asinīm. Zinātniskajā presē ir ziņots, ka hematopoētiskās cilmes šūnas spēj vairoties, ja tās kultivē vidē ar citokīniem. Izmantojot speciāli izstrādātus bioreaktorus hematopoētisko cilmes šūnu pavairošanai, ievērojami palielinās no kaulu smadzenēm, perifērajām vai nabassaites asinīm izolēto hematopoētisko cilmes šūnu biomasa. Hematopoētisko cilmes šūnu pavairošanas iespēja ir svarīgs solis ceļā uz šūnu transplantācijas klīnisko attīstību.

Tomēr pirms hematopoētisko cilmes šūnu pavairošanas in vitro ir nepieciešams izolēt homogēnu hematopoētisko cilmes šūnu populāciju. To parasti panāk, izmantojot marķierus, kas ļauj selektīvi marķēt hematopoētiskās cilmes šūnas ar monoklonālām antivielām, kas kovalenti saistītas ar fluorescējošu vai magnētisku marķējumu, un izolēt tās, izmantojot atbilstošu šūnu šķirotāju. Tajā pašā laikā hematopoētisko cilmes šūnu fenotipisko īpašību jautājums vēl nav pilnībā atrisināts. A. Petrenko, V. Griščenko (2003) par hematopoētisko cilmes šūnu kandidātiem uzskata šūnas ar CD34, AC133 un Thyl antigēniem uz to virsmas un bez CD38, HLA-DR vai citiem diferenciācijas marķieriem (šūnas ar CD34+Liir fenotipu). Līnijas (Lin) marķieri ietver glikoforīnu A (GPA), CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20 (Muench, 2001). Šūnas ar CD34+CD45RalüW CD71low fenotipu, kā arī CD34+Thyl+CD38low/c-kit/low fenotipu tiek uzskatītas par daudzsološām transplantācijai.

Joprojām pastāv problēmas ar pietiekamu hematopoētisko cilmes šūnu skaitu efektīvai transplantācijai. Pašlaik hematopoētisko cilmes šūnu avoti ir kaulu smadzenes, perifērās un nabassaites asinis, kā arī embrionālās aknas. Hematopoētisko cilmes šūnu paplašināšana tiek panākta, kultivējot tās endotēlija šūnu un hematopoētisko augšanas faktoru klātbūtnē. Dažādos protokolos mieloproteīni, SCF, eritropoetīns, insulīnam līdzīgie augšanas faktori, kortikosteroīdi un estrogēni tiek izmantoti, lai inducētu HSC proliferāciju. Lietojot citokīnu kombinācijas in vitro, ir iespējams panākt ievērojamu HSC kopuma palielināšanos, sasniedzot to ražības maksimumu otrās kultivēšanas nedēļas beigās.

Tradicionāli nabassaites asiņu hematopoētisko cilmes šūnu transplantācija galvenokārt tiek izmantota hemoblastožu gadījumā. Tomēr minimālā hematopoētisko šūnu deva, kas nepieciešama veiksmīgai nabassaites asiņu transplantācijai, ir 3,7 x 107 ^kodolu šūnas uz 1 kg recipienta ķermeņa masas. Izmantojot mazāku skaitu nabassaites asiņu hematopoētisko cilmes šūnu, ievērojami palielinās transplantāta atgrūšanas un slimības recidīva risks. Tāpēc nabassaites asiņu hematopoētisko cilmes šūnu transplantācija galvenokārt tiek izmantota hemoblastožu ārstēšanai bērniem.

Diemžēl joprojām nav standartu nabassaites asiņu hematopoētisko šūnu iegādei vai standartizētu protokolu klīniskai izmantošanai. Attiecīgi nabassaites asiņu cilmes šūnas pašas par sevi nav juridiski atzīts hematopoētisko šūnu avots transplantācijai. Turklāt nav ētikas vai juridisko normu, kas regulētu nabassaites asiņu banku darbību un organizāciju, kādas pastāv ārzemēs. Tikmēr drošai transplantācijai visi nabassaites asiņu paraugi ir rūpīgi jāuzrauga. Pirms asins savākšanas no grūtnieces ir jāsaņem viņas piekrišana. Katra grūtniece ir jāpārbauda uz HBsAg nēsāšanu, antivielu klātbūtni pret C hepatīta, HIV un sifilisa vīrusiem. Katrs nabassaites asiņu paraugs ir standarta testā jāpārbauda uz kodolīgo šūnu skaitu, CD34+ un koloniju veidošanas spēju. Turklāt tiek veikta HbA tipizēšana, asinsgrupas noteikšana pēc ABO un tās piederības noteikšana pēc Rh faktora. Nepieciešamās testēšanas procedūras ir bakterioloģiskā kultūra sterilitātes noteikšanai, seroloģiskā testēšana uz HIV-1 un HIV-2 infekcijām, HBsAg, vīrushepatītu C, citomegalovīrusa infekciju, HTLY-1 un HTLY-II, sifilisu un toksoplazmozi. Turklāt tiek veikta polimerāzes ķēdes reakcija, lai atklātu citomegalovīrusu un HIV infekcijas. Šķiet ieteicams papildināt testēšanas protokolus ar nabassaites asiņu GSC analīzi, lai atklātu tādas ģenētiskas slimības kā α-talasēmija, sirpjveida šūnu anēmija, adenozīna deamināzes deficīts, Brutona agammaglobulinēmija, Hērlera un Pontera slimības.

Nākamais transplantācijas sagatavošanās posms ir hematopoētisko cilmes šūnu saglabāšanas jautājums. Visbīstamākās procedūras šūnu dzīvotspējai to sagatavošanas laikā ir sasaldēšana un atkausēšana. Sasaldējot hematopoētiskās šūnas, ievērojama daļa no tām var tikt iznīcināta kristālu veidošanās dēļ. Lai samazinātu šūnu bojāejas procentuālo daudzumu, tiek izmantotas īpašas vielas - krioprotektori. Visbiežāk kā krioprotektoru izmanto DMSO galīgajā koncentrācijā 10%. Tomēr DMSO šādā koncentrācijā raksturo tieša citotoksiska iedarbība, kas izpaužas pat minimālas iedarbības apstākļos. Citotoksiskās iedarbības samazināšanās tiek panākta, stingri uzturot iedarbības režīma nulles temperatūru, kā arī ievērojot materiāla apstrādes noteikumus atkausēšanas laikā un pēc tās (visu manipulāciju ātrums, vairāku mazgāšanas procedūru izmantošana). Nedrīkst izmantot DMSO koncentrāciju, kas mazāka par 5%, jo tas izraisa masveida hematopoētisko šūnu bojāeju sasaldēšanas periodā.

Eritrocītu piemaisījumu klātbūtne hematopoētisko cilmes šūnu suspensijas maisījumā rada risku saderības reakcijas attīstībai ar eritrocītu antigēniem. Vienlaikus, noņemot eritrocītus, ievērojami palielinās hematopoētisko šūnu zudums. Šajā sakarā ir ierosināta hematopoētisko cilmes šūnu nefrakcionētas izolēšanas metode. Šajā gadījumā kodolu šūnu aizsardzībai no zemas temperatūras kaitīgās ietekmes tiek izmantots 10% DMSO šķīdums un nemainīga ātruma (GS/min) atdzesēšana līdz -80°C, pēc tam šūnu suspensija tiek sasaldēta šķidrā slāpeklī. Tiek uzskatīts, ka šī kriokonservācijas metode izraisa daļēju eritrocītu līzi, tāpēc asins paraugiem nav nepieciešama frakcionēšana. Pirms transplantācijas šūnu suspensija tiek atkausēta, mazgāta no brīvā hemoglobīna un DMSO cilvēka albumīna šķīdumā vai asins serumā. Hematopoētisko prekursoru saglabāšanās, izmantojot šo metodi, patiešām ir augstāka nekā pēc nabassaites asiņu frakcionēšanas, taču transfūzijas komplikāciju risks ABO nesaderīgu eritrocītu transfūzijas dēļ saglabājas.

Banku sistēmas izveide HLA testētu un tipizētu HSC paraugu glabāšanai varētu atrisināt iepriekš minētās problēmas. Tomēr tas prasa ētikas un tiesību normu izstrādi, kas pašlaik tiek tikai apspriestas. Pirms banku tīkla izveides ir jāpieņem vairāki noteikumi un dokumenti par HSC savākšanas, frakcionēšanas, testēšanas un tipizēšanas, kā arī kriokonservācijas procedūru standartizāciju. Obligāts nosacījums HSC banku efektīvai darbībai ir datorbāzes organizēšana mijiedarbībai ar Pasaules smadzeņu donoru asociācijas (WMDA) un Amerikas Savienoto Valstu Nacionālās smadzeņu donoru programmas (NMDP) reģistriem.

Turklāt ir nepieciešams optimizēt un standartizēt HSC in vitro pavairošanas metodes, galvenokārt nabassaites asiņu hematopoētisko šūnu pavairošanu. Nabassaites asiņu HSC pavairošana ir nepieciešama, lai palielinātu potenciālo recipientu skaitu, kas ir saderīgi ar HLA sistēmu. Nabassaites asiņu mazā tilpuma dēļ tajās esošo HSC skaits parasti nespēj nodrošināt kaulu smadzeņu repopulāciju pieaugušiem pacientiem. Tajā pašā laikā, lai veiktu nesaistītas transplantācijas, ir nepieciešams pieejams pietiekams skaits tipizētu HSC paraugu (no 10 000 līdz 1 500 000 uz vienu recipientu).

Hematopoētisko cilmes šūnu transplantācija neizslēdz komplikācijas, kas rodas kaulu smadzeņu transplantācijas laikā. Analīze liecina, ka pēc nabassaites asiņu cilmes šūnu transplantācijas smagas akūtas transplantāta atgrūšanas slimības formas attīstās 23% recipientu, bet hroniskas formas - 25% recipientu. Onkohematoloģiskiem pacientiem akūtas leikēmijas recidīvi pirmajā gadā pēc nabassaites asiņu cilmes šūnu transplantācijas tiek novēroti 26% gadījumu.

Pēdējos gados intensīvi attīstās perifēro hematopoētisko cilmes šūnu transplantācijas metodes. HSC saturs perifērajās asinīs ir tik mazs (1 HSC uz 100 000 asins šūnām), ka to izolēšana bez īpašas sagatavošanas nav jēgpilna. Tāpēc donoram vispirms tiek veikts medikamentozas kaulu smadzeņu hematopoētisko šūnu izdalīšanās asinīs stimulācijas kurss. Šim nolūkam tiek izmantoti tādi nebūt nekaitīgi medikamenti kā ciklofosfamīds un granulocītu koloniju stimulējošais faktors. Bet pat pēc HSC mobilizācijas procedūras perifērajās asinīs CD34+ šūnu saturs tajās nepārsniedz 1,6%.

Klīnikā hematopoētisko cilmes šūnu mobilizācijai visbiežāk izmanto S-SEC, kam raksturīga relatīvi laba tolerance, izņemot gandrīz dabisku kaulu sāpju rašanos. Jāatzīmē, ka mūsdienīgu asins separatoru izmantošana ļauj efektīvi izolēt hematopoētiskās cilmes šūnas. Tomēr normālos hematopoēzes apstākļos, lai iegūtu pietiekamu skaitu hematopoētisko cilmes šūnu, kuru repopulācijas spēja ir salīdzināma ar kaulu smadzeņu suspensiju, jāveic vismaz 6 procedūras. Katrai šādai procedūrai separatorā jāapstrādā 10–12 litri asiņu, kas var izraisīt trombocitopēniju un leikopēniju. Atdalīšanas procedūra ietver antikoagulanta (nātrija citrāta) ievadīšanu donorā, kas tomēr neizslēdz trombocītu kontakta aktivāciju ekstrakorporālas centrifugēšanas laikā. Šie faktori rada apstākļus infekcijas un hemorāģisku komplikāciju attīstībai. Vēl viens metodes trūkums ir mobilizācijas reakcijas ievērojamā mainība, kas prasa uzraudzīt HSC saturu donoru perifērajās asinīs, kas ir nepieciešams, lai noteiktu to maksimālo līmeni.

Autogēna hematopoētisko cilmes šūnu transplantācija, atšķirībā no allogēnas transplantācijas, pilnībā novērš atgrūšanas reakcijas attīstību. Tomēr būtisks hematopoētisko cilmes šūnu autotransplantācijas trūkums, kas ierobežo tās ieviešanas indikāciju klāstu, ir lielā leikēmisko klonu šūnu reinfūzijas varbūtība transplantātā. Turklāt imūnsistēmas mediēta "transplantāta pret audzēju" efekta neesamība ievērojami palielina ļaundabīgu asins slimību recidīvu biežumu. Tādēļ vienīgā radikālā metode neoplastiskas klonālās hematopoēzes likvidēšanai un normālas poliklonālās hematopoēzes atjaunošanai mielodisplastiskos sindromos joprojām ir intensīva poliķemoterapija ar allogēnas hematopoēzes transplantāciju.

Bet pat šajā gadījumā ārstēšana vairumam hemoblastožu ir vērsta tikai uz pacientu izdzīvošanas laika palielināšanu un dzīves kvalitātes uzlabošanu. Saskaņā ar vairākiem lieliem pētījumiem, ilgstoša dzīvildze bez recidīva pēc HSC allotransplantācijas tiek sasniegta 40% onkohematoloģisko pacientu. Izmantojot HLA saderīgu brāļu un māsu cilmes šūnas, labākie rezultāti tiek novēroti jauniem pacientiem ar īsu slimības anamnēzi, blastu šūnu skaitu līdz 10% un labvēlīgu citoģenētiku. Diemžēl mirstība, kas saistīta ar HSC allotransplantācijas procedūru pacientiem ar mielodisplaziskām slimībām, joprojām ir augsta (vairumā ziņojumu - aptuveni 40%). ASV Nacionālās kaulu smadzeņu donoru programmas 10 gadu darba rezultāti (510 pacienti, vidējais vecums - 38 gadi) liecina, ka divu gadu dzīvildze bez recidīva ir 29% ar relatīvi zemu recidīva varbūtību (14%). Tomēr mirstība, kas saistīta ar HSC allotransplantācijas procedūru no nesaistīta donora, ir ārkārtīgi augsta un divu gadu laikā sasniedz 54%. Līdzīgi rezultāti tika iegūti Eiropas pētījumā (118 pacienti, vidējais vecums - 24 gadi, divu gadu dzīvildze bez recidīva - 28%, recidīvs - 35%, mirstība - 58%).

Intensīvu ķīmijterapijas kursu laikā ar sekojošu hematopoēzes atjaunošanu ar alogēnām hematopoētiskām šūnām bieži rodas imūnhematoloģiskas un transfūzijas komplikācijas. Tās lielā mērā ir saistītas ar to, ka cilvēka asinsgrupas tiek mantotas neatkarīgi no MHC molekulām. Tādēļ, pat ja donors un recipients ir saderīgi attiecībā uz galvenajiem HLA antigēniem, viņu eritrocītiem var būt atšķirīgi fenotipi. Izšķir "galveno" nesaderību, kad recipientam jau ir antivielas pret donora eritrocītu antigēniem, un "nelielo" nesaderību, kad donoram ir antivielas pret recipienta eritrocītu antigēniem. Iespējami "galvenās" un "nelielās" nesaderības kombinācijas gadījumi.

Salīdzinošās analīzes rezultāti par kaulu smadzeņu un nabassaites asiņu hematopoētisko cilmes šūnu alotransplantācijas klīnisko efektivitāti hemoblastozēs liecina, ka bērniem pēc nabassaites asiņu hematopoētisko cilmes šūnu alotransplantācijas transplantāta pret saimnieka reakcijas attīstības risks ir ievērojami samazināts, bet tiek novērots ilgāks neitrofilu un trombocītu skaita atjaunošanās periods ar lielāku 100 dienu pēctransplantācijas mirstības biežumu.

Agrīnas mirstības cēloņu izpēte ļāva noskaidrot kontrindikācijas alogēnai HSC transplantācijai, starp kurām vissvarīgākās ir:

• pozitīvu citomegalovīrusa infekcijas testu klātbūtne recipientam vai donoram (bez profilaktiskas ārstēšanas);
• akūta staru slimība;
• mikotiskas infekcijas klātbūtne vai pat aizdomas par to pacientam (neveicot sistēmisku agrīnu profilaksi ar fungicīdiem līdzekļiem);
• hemoblastozes, kurās pacienti ilgstoši saņēma citostatisku terapiju (sakarā ar lielu pēkšņas sirdsdarbības apstāšanās un vairāku orgānu mazspējas varbūtību);
• transplantācija no HLA neidentiskiem donoriem (bez akūtas transplantāta pret saimnieka reakcijas profilakses ar ciklosporīnu A);
• hronisks vīrusu C hepatīts (augsta aknu vēnu nosprostošanās slimības riska dēļ).

Tādējādi HSC transplantācija var izraisīt nopietnas komplikācijas, kas bieži vien noved pie nāves. Agrīnā periodā (līdz 100 dienām pēc transplantācijas) tās ir infekcijas komplikācijas, akūta transplantāta atgrūšana, transplantāta atgrūšana (donora HSC mazspēja), vēnu nosprostošanās aknu slimība, kā arī audu bojājumi, ko izraisa kondicionēšanas režīma toksicitāte, kam raksturīgs augsts remodelācijas ātrums (āda, asinsvadu endotēlijs, zarnu epitēlijs). Vēlā pēctransplantācijas perioda komplikācijas ir hroniska transplantāta atgrūšana, pamatslimības recidīvi, augšanas aizkavēšanās bērniem, reproduktīvās sistēmas un vairogdziedzera disfunkcija un acu bojājumi.

Nesen saistībā ar publikācijām par kaulu smadzeņu šūnu plastiskumu ir radusies ideja par HSC izmantošanu sirdslēkmju un citu slimību ārstēšanā. Lai gan daži eksperimenti ar dzīvniekiem apstiprina šo iespēju, secinājumi par kaulu smadzeņu šūnu plastiskumu ir jāapstiprina. Šis apstāklis jāņem vērā tiem pētniekiem, kuri uzskata, ka transplantētas cilvēka kaulu smadzeņu šūnas viegli transformējas skeleta muskuļu, miokarda vai CNS šūnās. Hipotēzei, ka HSC ir dabisks šūnu avots šo orgānu reģenerācijai, ir nepieciešami nopietni pierādījumi.

Konkrēti, ir publicēti pirmie V. Belenkova (2003) atklātā randomizētā pētījuma rezultāti. Tā mērķis bija pētīt C-SvK (t.i., autologu HSC mobilizāciju asinīs) ietekmi uz pacientu ar vidēji smagu vai smagu hronisku sirds mazspēju klīnisko, hemodinamisko un neirohumorālo stāvokli, kā arī novērtēt tā drošību uz standarta terapijas fona (angiotenzīnu konvertējošā enzīma inhibitori, beta blokatori, diurētiskie līdzekļi, sirds glikozīdi). Pētījuma rezultātu pirmajā publikācijā programmas autori norāda, ka vienīgais arguments par labu O-SvK ir viena pacienta ārstēšanas rezultāti, kuram, lietojot šo medikamentu, tika novērota neapstrīdama visu klīnisko un hemodinamisko parametru uzlabošanās. Tomēr teorija par HSC mobilizāciju asinsritē ar sekojošu miokarda reģenerāciju pēcinfarkta zonā netika apstiprināta - pat pacientam ar pozitīvu klīnisko dinamiku stresa ehokardiogrāfija ar dobutamīnu neatklāja dzīvotspējīga miokarda zonu parādīšanos rētas zonā.

Jāatzīmē, ka pašlaik ir acīmredzami nepietiekami dati, lai ieteiktu aizvietojošo šūnu terapiju plašai ieviešanai ikdienas klīniskajā praksē. Ir nepieciešami labi izstrādāti un augstas kvalitātes klīniskie pētījumi, lai noteiktu dažādu reģeneratīvās šūnu terapijas iespēju efektivitāti, izstrādātu tās indikācijas un kontrindikācijas, kā arī vadlīnijas reģeneratīvi plastiskās terapijas un tradicionālās ķirurģiskās vai konservatīvās ārstēšanas kombinētai lietošanai. Joprojām nav atbildes uz jautājumu, kura konkrētā kaulu smadzeņu šūnu populācija (cilmes hematopoētiskā vai stromas) var radīt neironus un kardiomiocītus, un nav arī skaidrs, kādi apstākļi to veicina in vivo.

Darbs šajās jomās tiek veikts daudzās valstīs. ASV Nacionālo veselības institūtu akūtas aknu mazspējas simpozija kopsavilkumā starp daudzsološām ārstēšanas metodēm līdzās aknu transplantācijai tiek minēta kseno- vai allogēnu hepatocītu transplantācija un bioreaktoru ekstrakorporāla savienošana ar aknu šūnām. Ir tieši pierādījumi, ka tikai sveši funkcionāli aktīvi hepatocīti spēj nodrošināt efektīvu atbalstu recipienta aknām. Izolētu hepatocītu klīniskai lietošanai ir nepieciešams izveidot šūnu banku, kas ievērojami samazinās laiku starp šūnu izolēšanu un to izmantošanu. Pieņemamākā metode izolētu hepatocītu bankas izveidei ir aknu šūnu kriokonservācija šķidrā slāpeklī. Izmantojot šādas šūnas klīnikā pacientiem ar akūtu un hronisku aknu mazspēju, ir atklāts diezgan augsts terapeitiskais efekts.

Neskatoties uz optimistiskajiem un iepriecinošajiem aknu šūnu transplantācijas rezultātiem eksperimentos un klīniskajā praksē, joprojām pastāv daudzas problēmas, kas nebūt nav atrisinātas. Tās ietver ierobežotu orgānu skaitu, kas piemēroti izolētu hepatocītu iegūšanai, nepietiekami efektīvas metodes to izolēšanai, standartizētu metožu trūkumu aknu šūnu saglabāšanai, neskaidrus priekšstatus par transplantēto šūnu augšanas un proliferācijas regulēšanas mehānismiem, atbilstošu metožu trūkumu allogēno hepatocītu iesakņošanās vai atgrūšanas novērtēšanai. Tas ietver arī transplantāta imunitātes klātbūtni, lietojot allogēnas un ksenogēnas šūnas, lai gan mazāk nekā ortotopiskā aknu transplantācijā, bet kas prasa imūnsupresantu lietošanu, izolētu hepatocītu iekapsulēšanu vai to īpašu apstrādi ar enzīmiem. Hepatocītu transplantācija bieži noved pie imūnkonflikta starp recipientu un donoru atgrūšanas reakcijas veidā, kam nepieciešama citostatisko līdzekļu lietošana. Viens no šīs problēmas risinājumiem varētu būt polimēru mikroporainu nesēju izmantošana aknu šūnu izolēšanai, kas uzlabos to izdzīvošanu, jo kapsulas membrāna efektīvi aizsargā hepatocītus, neskatoties uz saimnieka imunizāciju.

Tomēr akūtas aknu mazspējas gadījumā šāda hepatocītu transplantācija ir neefektīva, jo aknu šūnām nepieciešams relatīvi ilgs laiks, lai tās adaptētos jaunā vidē un sasniegtu optimālas funkcionēšanas stadiju. Potenciāls ierobežojums ir žults sekrēcija izolētu hepatocītu ektopiskas transplantācijas laikā, un, izmantojot bioreaktorus, būtiska fizioloģiska barjera ir sugu neatbilstība starp cilvēka olbaltumvielām un ksenogēno hepatocītu ražotajām olbaltumvielām.

Literatūrā ir ziņojumi, ka lokāla kaulu smadzeņu stromas cilmes šūnu transplantācija veicina efektīvu kaulu defektu korekciju, un kaulu audu atjaunošana šajā gadījumā notiek intensīvāk nekā ar spontānu reparatīvu reģenerāciju. Vairāki preklīniskie pētījumi ar eksperimentāliem modeļiem pārliecinoši pierāda kaulu smadzeņu stromas šūnu transplantācijas izmantošanas iespēju ortopēdijā, lai gan ir nepieciešams turpmāks darbs, lai optimizētu šīs metodes pat vienkāršākajos gadījumos. Jo īpaši vēl nav atrasti optimāli apstākļi osteogēno stromas šūnu paplašināšanai ex vivo, un to ideālā nesēja (matricas) struktūra un sastāvs joprojām nav attīstīts. Nav noteikts minimālais šūnu skaits, kas nepieciešams apjomīgai kaulu reģenerācijai.

Ir pierādīts, ka mezenhimālajām cilmes šūnām piemīt transgermāla plastiskums, t. i., spēja diferencēties šūnu tipos, kas fenotipiski nav saistīti ar sākotnējās līnijas šūnām. Optimālos kultivēšanas apstākļos poliklonālās kaulu smadzeņu stromas cilmes šūnu līnijas in vitro var izturēt vairāk nekā 50 dalīšanās, kas ļauj iegūt miljardiem stromas šūnu no 1 ml kaulu smadzeņu aspirāta. Tomēr mezenhimālo cilmes šūnu populācija ir heterogēna, kas izpaužas gan koloniju izmēru mainīgumā, gan atšķirīgā to veidošanās ātrumā, gan šūnu tipu morfoloģiskajā daudzveidībā, sākot no fibroblastiem līdzīgām vārpstveida šūnām līdz lielām plakanām šūnām. Fenotipiska heterogenitāte tiek novērota jau pēc 3 nedēļām pēc stromas cilmes šūnu kultivēšanas: dažas kolonijas veido kaulu audu mezgliņus, citas veido adipocītu kopas, bet citas, retāk, veido skrimšļu audu saliņas.

Embrionālo nervu audu transplantācija sākotnēji tika izmantota centrālās nervu sistēmas deģeneratīvu slimību ārstēšanai. Pēdējos gados embrionālo smadzeņu audu vietā tiek transplantēti no neironu cilmes šūnām iegūti neirosfēru šūnu elementi (Poltavtseva, 2001). Neirosfēras satur neironu un neirogliju prekursorus, kas dod cerību uz zaudēto smadzeņu funkciju atjaunošanos pēc to transplantācijas. Pēc izkliedētu neirosfēras šūnu transplantācijas žurku smadzeņu striatuma reģionā tika novērota to proliferācija un diferenciācija par dopamīnerģiskiem neironiem, kas novērsa motorisko asimetriju žurkām ar eksperimentālu hemiparkinsonismu. Tomēr dažos gadījumos no neirosfēras šūnām attīstījās audzēji, kas izraisīja dzīvnieku nāvi (Bjorklund, 2002).

Klīnikā rūpīgi pētot divas pacientu grupas, kurās ne pacienti, ne viņus novērojošie ārsti nezināja (dubultmaskēts pētījums), ka vienai pacientu grupai tika transplantēti embrionālie audi ar dopamīnu ražojošiem neironiem, bet otrai pacientu grupai tika veikta fiktīva operācija, tika iegūti negaidīti rezultāti. Pacienti, kuriem tika transplantēti embrionālie nervu audi, nejutās labāk nekā kontroles grupas pacienti. Turklāt 5 no 33 pacientiem 2 gadus pēc embrionālo nervu audu transplantācijas attīstījās pastāvīga diskinēzija, kas nebija novērojama kontroles grupas pacientiem (Cilmes šūnas: zinātnes progress un nākotnes pētījumu virzieni. Nat. Inst, of Health. USA). Viena no neatrisinātajām smadzeņu neironu cilmes šūnu klīniskās izpētes problēmām joprojām ir to atvasinājumu transplantācijas reālo perspektīvu un ierobežojumu analīze CNS traucējumu korekcijai. Iespējams, ka ilgstošas krampju aktivitātes izraisīta neiroģenēze hipokampā, kas noved pie tā strukturālas un funkcionālas reorganizācijas, var būt faktors epilepsijas progresējošā attīstībā. Šis secinājums ir pelnījis īpašu uzmanību, jo tas norāda uz iespējamām negatīvām sekām, ko rada jaunu neironu ģenerēšana nobriedušās smadzenēs un to radīto aberantu sinaptisko savienojumu veidošanās.

Nedrīkst aizmirst, ka kultivēšana vidēs ar citokīniem (mitogēniem) tuvina cilmes šūnu īpašības audzēja šūnu īpašībām, jo tajās notiek līdzīgas izmaiņas šūnu ciklu regulācijā, kas nosaka spēju neierobežoti dalīties. Ir neapdomīgi transplantēt cilvēkam agrīnus embrionālo cilmes šūnu atvasinājumus, jo šajā gadījumā ļaundabīgo audzēju attīstības risks ir ļoti augsts. Daudz drošāk ir izmantot to apņēmīgākos pēcnācējus, tas ir, diferencētu līniju priekšteču šūnas. Tomēr pašlaik vēl nav izstrādāta uzticama metode stabilu cilvēka šūnu līniju iegūšanai, kas diferencējas vēlamajā virzienā.

Molekulārās bioloģijas tehnoloģiju izmantošana iedzimtu patoloģiju un cilvēku slimību korekcijai, modificējot cilmes šūnas, ir ļoti interesanta praktiskajai medicīnai. Cilmes šūnu genoma īpašības ļauj izstrādāt unikālas transplantācijas shēmas ģenētisko slimību korekcijai. Tomēr šajā jomā pastāv virkne ierobežojumu, kas jāpārvar pirms cilmes šūnu ģenētiskās inženierijas praktiskas pielietošanas. Pirmkārt, ir jāoptimizē cilmes šūnu genoma modifikācijas process ex vivo. Ir zināms, ka ilgstoša (3-4 nedēļu) cilmes šūnu proliferācija samazina to transfekciju, tāpēc, lai sasniegtu augstu to ģenētiskās modifikācijas līmeni, ir nepieciešami vairāki transfekcijas cikli. Tomēr galvenā problēma ir saistīta ar terapeitiskās gēnu ekspresijas ilgumu. Līdz šim nevienā pētījumā modificētu šūnu transplantācijas efektīvās ekspresijas periods nav pārsniedzis četrus mēnešus. 100% gadījumu laika gaitā transfektēto gēnu ekspresija samazinās promotoru inaktivācijas un/vai šūnu ar modificētu genomu nāves dēļ.

Svarīgs jautājums ir šūnu tehnoloģiju izmantošanas izmaksas medicīnā. Piemēram, aprēķinātā ikgadējā nepieciešamība finansēt tikai kaulu smadzeņu transplantācijas nodaļas, kas paredzēta 50 transplantāciju veikšanai gadā, medicīniskos izdevumus ir aptuveni 900 000 ASV dolāru.

Šūnu tehnoloģiju attīstība klīniskajā medicīnā ir sarežģīts un daudzpakāpju process, kas ietver konstruktīvu sadarbību starp daudznozaru zinātnes un klīniskiem centriem un starptautisko sabiedrību. Vienlaikus īpaša uzmanība jāpievērš pētījumu zinātniskās organizācijas jautājumiem šūnu terapijas jomā. Svarīgākie no tiem ir klīnisko pētījumu protokolu izstrāde, klīnisko datu ticamības kontrole, nacionālā pētījumu reģistra veidošana, integrācija starptautiskajās daudzcentru klīnisko pētījumu programmās un rezultātu ieviešana klīniskajā praksē.

Noslēdzot ievadu šūnu transplantoloģijas problēmās, vēlos izteikt cerību, ka dažādu zinātnes jomu vadošo Ukrainas speciālistu centienu apvienošana nodrošinās ievērojamu progresu eksperimentālajos un klīniskajos pētījumos un ļaus turpmākajos gados atrast efektīvus veidus, kā sniegt palīdzību smagi slimiem cilvēkiem, kuriem nepieciešama orgānu, audu un šūnu transplantācija.

[ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ], [ 17 ], [ 18 ]