Molekulāri ģenētiskās metodes iedzimtu slimību diagnosticēšanai

DNS tehnoloģijas metodes tiek izmantotas, lai noteiktu mutanta gēna lokalizāciju konkrētā hromosomā, kas ir atbildīga par noteiktu iedzimtu patoloģiju formu izcelsmi. Tā kā gēns ir DNS daļa, un gēna mutācija ir DNS primārās struktūras bojājums (ar mutāciju saprot visas izmaiņas DNS secībā neatkarīgi no to lokalizācijas un ietekmes uz indivīda dzīvotspēju), tad, zondējot pacienta ar iedzimtu slimību metafāzes hromosomu preparātus, ir iespējams noteikt patoloģiskā gēna lokalizāciju. Molekulārās ģenētiskās metodes rada iespējas diagnosticēt slimības izmainītas DNS struktūras līmenī, tās ļauj noteikt iedzimtu traucējumu lokalizāciju. Molekulārās ģenētiskās metodes var identificēt mutācijas, kas saistītas pat ar vienas atsevišķas bāzes aizvietošanu.

Vissvarīgākais gēna identifikācijas posms ir tā izolēšana. DNS var izolēt no jebkura veida audiem un šūnām, kas satur kodolus. DNS izolēšanas posmi ietver: šūnu ātru līzi, šūnu organellu un membrānu fragmentu atdalīšanu ar centrifugēšanas palīdzību, olbaltumvielu fermentatīvu iznīcināšanu un to ekstrakciju no šķīduma, izmantojot fenolu un hloroformu, DNS molekulu koncentrēšanu, nogulsnējot etanolā.

Ģenētiskajās laboratorijās DNS visbiežāk tiek izolēta no asins leikocītiem, un šim nolūkam no pacienta tiek ņemti 5–20 ml venozo asiņu sterilā mēģenē ar antikoagulanta šķīdumu (heparīnu). Pēc tam leikocītus atdala un apstrādā saskaņā ar iepriekš minētajām darbībām.

Nākamais pētījuma materiāla sagatavošanas posms ir DNS “sagriešana” fragmentos apgabalos ar stingri specifisku bāzes secību, ko veic, izmantojot baktēriju enzīmus - restrikcijas endonukleāzes (restrikcijas enzīmus). Restrikcijas enzīmi atpazīst specifiskas 4-6, retāk 8-12 nukleotīdu sekvences divpavedienu DNS molekulā un sadala to fragmentos šo secību vietās, ko sauc par restrikcijas vietām. Iegūto DNS restrikcijas fragmentu skaitu nosaka restrikcijas vietu rašanās biežums, un fragmentu lielumu nosaka šo vietu sadalījuma raksturs sākotnējās DNS molekulas garumā. Jo biežāk atrodas restrikcijas vietas, jo īsāki ir DNS fragmenti pēc restrikcijas. Pašlaik ir zināmi vairāk nekā 500 dažādu baktēriju izcelsmes restrikcijas enzīmu veidi, un katrs no šiem enzīmiem atpazīst savu specifisko nukleotīdu secību. Nākotnē restrikcijas vietas varēs izmantot kā DNS ģenētiskos marķierus. Restrikcijas rezultātā izveidotos DNS fragmentus var sakārtot pēc garuma, veicot elektroforēzi agarozes vai poliakrilamīda gelā, un tādējādi var noteikt to molekulmasu. Parasti DNS gēlā tiek identificēta ar specifisku krāsošanu (parasti ar etīdija bromīdu) un gēla apskati caurlaidīgā ultravioletā gaismā. DNS lokalizācijas vietas ir iekrāsotas sarkanā krāsā. Tomēr cilvēkiem, apstrādājot DNS ar vairākiem restrikcijas enzīmiem, veidojas tik daudz dažāda garuma fragmentu, ka tos nevar atdalīt ar elektroforēzi, t.i., elektroforēzē nav iespējams vizuāli identificēt atsevišķus DNS fragmentus (vienmērīga iekrāsošanās tiek iegūta visā gēla garumā). Tāpēc, lai šādā gēlā identificētu vēlamos DNS fragmentus, tiek izmantota hibridizācijas metode ar iezīmētām DNS zondēm.

Jebkurš vienpavedienu DNS vai RNS segments spēj saistīties (hibridizēties) ar komplementāru virkni, guanīnam vienmēr saistoties ar citozīnu, bet adenīnam ar timīnu. Tādā veidā veidojas divpavedienu molekula. Ja klonēta gēna vienpavedienu kopija tiek iezīmēta ar radioaktīvu marķieri, tiek iegūta zonde. Zonde spēj atrast komplementāru DNS segmentu, ko pēc tam viegli identificēt, izmantojot autoradiogrāfiju. Radioaktīvā zonde, kas pievienota izstieptu hromosomu preparātam, ļauj lokalizēt gēnu noteiktā hromosomā: izmantojot DNS zondi, Southern blotēšanas laikā var identificēt specifiskas zonas. Hibridizācija notiek, ja testējamā DNS sadaļa satur normālu gēnu. Gadījumā, ja ir patoloģiska nukleotīdu secība, t.i., atbilstošajās hromosomu struktūrās ir mutants gēns, hibridizācija nenotiks, kas ļauj noteikt patoloģiskā gēna lokalizāciju.

Lai iegūtu DNS zondes, tiek izmantota gēnu klonēšanas metode. Metodes būtība ir tāda, ka DNS fragments, kas atbilst gēnam vai gēna daļai, tiek ievietots klonēšanas daļiņā, parasti baktēriju plazmīdā (gredzenveida ekstrahromosomāla DNS, kas atrodas baktēriju šūnās un nes antibiotiku rezistences gēnus), un pēc tam baktērijas ar plazmīdu, kurā ir ievietots cilvēka gēns, tiek pavairotas. Pateicoties sintēzes procesiem plazmīdā, var iegūt miljardiem cilvēka gēna vai tā daļas kopiju.

Iegūtās DNS kopijas, kas marķētas ar radioaktīvu marķējumu vai fluorohromiem, pēc tam tiek izmantotas kā zondes, lai meklētu komplementāras sekvences pētītajā DNS molekulu kopā.

Pašlaik ir daudz dažādu metožu, kurās gēnu mutāciju diagnosticēšanai tiek izmantotas DNS zondes.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]