Mezenhīma cilmes šūnas

Reģionālo cilmes šūnu vidū īpašu vietu ieņem mezenhimālās cilmes šūnas (MSC), kuru atvasinājumi veido visu cilvēka ķermeņa orgānu un audu stromas matricu. MSC pētījumu prioritāte pieder Krievijas bioloģijas zinātnes pārstāvjiem.

Pagājušā gadsimta vidū A. Frīdenšteina laboratorijā pirmo reizi tika izolēta homogēna multipotentu kaulu smadzeņu stromas cilmes šūnu kultūra. Pie substrāta piestiprinātas mezenhīmas cilmes šūnas ilgstoši saglabāja augstu proliferācijas intensitāti, un kultūrās ar zemu sēšanas blīvumu pēc fiksācijas uz substrāta tās veidoja fibroblastiem līdzīgu šūnu klonus, kuriem nebija fagocitārās aktivitātes. MSC proliferācijas pārtraukšana beidzās ar to spontānu diferenciāciju in vitro par kaulu, tauku, skrimšļu, muskuļu vai saistaudu šūnām. Turpmākie pētījumi ļāva noteikt dažādu zīdītāju sugu kaulu smadzeņu stromas fibroblastiem līdzīgu šūnu osteogēno potenciālu, kā arī to koloniju veidojošo aktivitāti. In vivo eksperimenti ir parādījuši, ka gan hetero-, gan ortotopiska koloniju veidojošo fibroblastiem līdzīgu šūnu transplantācija izraisa kaulu, skrimšļu, šķiedru un taukaudu veidošanos. Tā kā kaulu smadzeņu stromas cilmes šūnām raksturīga augsta pašatjaunošanās spēja un daudzpusīga diferenciācija vienas šūnu līnijas ietvaros, tās sauc par multipotentām mezenhimālām cilmes šūnām.

Jāatzīmē, ka vairāk nekā 45 gadu fundamentālo pētījumu laikā par mezenhimālajām cilmes šūnām ir radīti reāli apstākļi to atvasinājumu izmantošanai klīniskajā praksē.

Mūsdienās nav šaubu, ka visi cilvēka ķermeņa audi veidojas no dažādu šūnu līniju cilmes šūnām proliferācijas, migrācijas, diferenciācijas un nobriešanas procesu rezultātā. Tomēr līdz nesenam laikam tika uzskatīts, ka pieauguša organisma cilmes šūnas ir audu specifiskas, t.i., spējīgas producēt specializētu šūnu līnijas tikai no tiem audiem, kuros tās atrodas. Šo konceptuālo nostāju atspēkoja hematopoētisko cilmes šūnu transformācijas fakti ne tikai perifēro asiņu šūnu elementos, bet arī aknu ovālajās šūnās. Turklāt izrādījās, ka neirālās cilmes šūnas spēj radīt gan neironus, gan gliālus elementus, kā arī agrīni specializētas hematopoētisko cilmes šūnu līnijas. Savukārt mezenhimālās cilmes šūnas, kas parasti producē kaulu, skrimšļu un taukaudu šūnu elementus, spēj transformēties par neirālajām cilmes šūnām. Tiek pieņemts, ka augšanas, fizioloģiskās un reparatīvās audu reģenerācijas procesā no audiem nespecifiskām cilmes šūnu rezervēm rodas nesaistītas cilmes šūnas. Piemēram, muskuļu audu reparācija var tikt realizēta, pateicoties mezenhimālo cilmes šūnu migrācijai no kaulu smadzenēm uz skeleta muskuļiem.

Lai gan šādu cilmes šūnu savstarpējo aizvietojamību neatzīst visi pētnieki, mezenhimālo cilmes šūnu klīniskās izmantošanas iespēja kā šūnu transplantācijas avots un ģenētiskās informācijas šūnu vektors vairs netiek apstrīdēta neviena vidū, tāpat kā kaulu smadzeņu stromas cilmes šūnu multipotence, kuras var relatīvi viegli izolēt un paplašināt in vitro kultūrā. Tajā pašā laikā zinātniskajā literatūrā turpina parādīties ziņojumi par kaulu smadzeņu stromas cilmes šūnu potenciālo pluripotenci. Kā pierādījumi tiek minēti pētījumu protokoli, kuros specifisku transdiferenciācijas induktoru ietekmē MSC tiek pārveidotas par nervu šūnām, kardiomiocītiem un hepatocītiem. Tomēr dažiem zinātniekiem ir nopietnas šaubas par gēnu atkārtotas aktivācijas un ekspresijas iespējamību no agrīnās embrioģenēzes perioda. Tajā pašā laikā visi saprot, ka, ja tiks atrasti apstākļi mezenhimālo cilmes šūnu multipotences paplašināšanai līdz ESC pluripotencei, daudzas ētiskas, morālas, reliģiskas un juridiskas problēmas reģeneratīvajā plastiskajā medicīnā tiks automātiski atrisinātas. Turklāt, tā kā šajā gadījumā reģeneratīvā cilmes potenciāla avots kļūst par pacienta autologām stromas šūnām, tiek atrisināta arī šūnu transplantāta imūnās atgrūšanas problēma. Tuvākā nākotne parādīs, cik reālas ir šīs perspektīvas.

[ 1 ], [ 2 ]

Mezenhimālo cilmes šūnu izmantošana medicīnā

Klīnikā mezenhimālo cilmes šūnu atvasinājumu izmantošana galvenokārt ir saistīta ar audu defektu atjaunošanu, kas rodas plašu un dziļu termisku ādas bojājumu gadījumā. Preklīniskajā stadijā tika veikts eksperimentāls novērtējums par allogēnu fibroblastiem līdzīgu mezenhimālo cilmes šūnu izmantošanas iespējamību dziļu apdegumu ārstēšanā. Tika pierādīts, ka kaulu smadzeņu fibroblastiem līdzīgas mezenhimālās cilmes šūnas kultūrā veido monoslāni, kas ļauj tās transplantēt, lai optimizētu dziļu apdegumu brūču reģenerācijas procesus. Autori norāda, ka embrionālajiem fibroblastiem piemīt līdzīga īpašība, taču to klīnisko izmantošanu ierobežo esošās ētiskās un juridiskās problēmas. Dziļš termisks apdegums ar visu ādas slāņu bojājumiem tika modelēts uz Wistar žurkām. Apdeguma laukums bija 18-20% no kopējās ādas virsmas. Pirmajā eksperimentālajā grupā bija iekļautas žurkas ar dziļu termisku apdegumu un allogēnu fibroblastiem līdzīgu mezenhimālo cilmes šūnu transplantāciju. Otrajā grupā bija dzīvnieki ar dziļu termisku apdegumu un allogēnu embrionālo fibroblastu transplantāciju. Trešo grupu pārstāvēja kontroles žurkas ar dziļu termisku apdegumu, kurām netika veikta šūnu terapija. Apdeguma brūces virsmai ar pipeti tika uzklāta fibroblastiem līdzīgu mezenhimālo cilmes šūnu un embrionālo fibroblastu suspensija 2 x ^10⁻⁴ daudzumā.šūnas otrajā dienā pēc apdeguma modelēšanas un iegūtās nekrotiskās kreveles izgriešanas. Pēc šūnu transplantācijas apdeguma virsma tika pārklāta ar marles salveti, kas samitrināta ar izotonisku nātrija hlorīda šķīdumu ar gentamicīnu. Kaulu smadzeņu šūnas tika savāktas, lai iegūtu MSC, un pēc tam tās tika inducētas fibroblastiem līdzīgu mezenhimālo cilmes šūnu līnijā no pieaugušām Wistar žurkām no augšstilba kauliem. Embrionālie fibroblasti tika iegūti no 14–17 dienas vecu embriju plaušām. Embrionālie fibroblasti un kaulu smadzeņu šūnas MSC iegūšanai tika iepriekš kultivētas Petri trauciņos 37°C temperatūrā CO2 inkubatorā, atmosfērā ar 5% CO2 un 95% mitrumu. Embrionālie fibroblasti tika kultivēti 4–6 dienas, savukārt MSC monoslāņa veidošanās ilga no 14 līdz 17 dienām. Pēc tam MSC tika kriokonservētas kā izejmateriāls fibroblastiem līdzīgām mezenhimālām cilmes šūnām, kuras tika iegūtas, atkausējot un kultivējot MSC 4 dienas. Izveidojušos fibroblastiem līdzīgo mezenhimālo cilmes šūnu skaits bija vairāk nekā 3 reizes lielāks nekā tajā pašā kultivēšanas periodā izveidojušos embrionālo fibroblastu skaits. Lai identificētu transplantētās šūnas apdegumu brūcēs kultivēšanas stadijā, to genoms tika iezīmēts, izmantojot vīrusu atspoles vektoru, kura pamatā ir rekombinants V tipa adenovīruss, kas satur 1ac-2 gēnu, kas kodē E. coli ß-galaktozidāzi. Dzīvas šūnas dažādos laikos pēc transplantācijas tika noteiktas imūnhistoķīmiski kriogēnās sekcijās, pievienojot X-Gal substrātu, kas dod raksturīgu zilganzaļu krāsojumu. Dinamiskās vizuālās, planimetriskās un histoloģiskās apdegumu brūces stāvokļa novērtēšanas rezultātā tika konstatēts, ka jau 3. dienā pēc šūnu transplantācijas atlasītajās grupās parādās būtiskas atšķirības brūces procesa gaitā. Šī atšķirība kļuva īpaši izteikta 7. dienā pēc šūnu transplantācijas. Pirmās grupas dzīvniekiem, kuriem tika transplantētas fibroblastiem līdzīgās mezenhimālās cilmes šūnas, brūce ieguva vienmērīgi intensīvi rozā krāsu, granulācijas audi izauga visā tās platībā līdz epidermas līmenim, un apdeguma virsma ievērojami samazinājās. Uz brūces virsmas izveidojusies kolagēna plēvīte kļuva nedaudz plānāka, taču tā turpināja segt visu apdeguma laukumu. Otrās grupas dzīvniekiem, kuriem tika transplantēti embrionālie fibroblasti, granulācijas audi pacēlās līdz brūces malu epidermas līmenim, bet tikai vietām, savukārt plazmoreja no brūces bija intensīvāka nekā 1. grupā, un sākotnēji izveidojusies kolagēna plēvīte praktiski izzuda. Dzīvniekiem, kuri nesaņēma šūnu terapiju, 7. dienā apdeguma brūce bija bāla, bedraina, nekrotiski audi, pārklāti ar fibrīnu. Plazmoreja tika novērota visā apdeguma virsmā. Histoloģiski 1. un 2. grupas dzīvniekiem bija novērojama šūnu infiltrācijas samazināšanās un asinsvadu tīkla attīstība,un šīs uzsāktā reģenerācijas procesa pazīmes bija izteiktākas 1. grupas žurkām. Kontroles grupā tika novērotas brūces šūnu infiltrācijas pazīmes, nebija novērojams jaunveidojušos asinsvadu histoloģiskais modelis. Novērošanas 15.–30. dienā 1. grupas dzīvniekiem apdeguma virsmas laukums bija ievērojami mazāks nekā citu grupu žurkām, un granulācijas virsma bija vairāk attīstīta. Arī 2. grupas dzīvniekiem apdeguma virsmas laukums samazinājās, salīdzinot ar kontroles grupas žurku apdegumu brūču izmēru, kas radās marginālas epitelizācijas dēļ. Kontroles grupā apdeguma virsma vietām palika bāla ar retām granulācijām, uz tās parādījās asinsvadu zvaigznītes, bija fibrīna plāksnes saliņas, mērena plazmoreja turpinājās pa visu apdeguma virsmu, un dažviet saglabājās grūti atdalāma krevele. Kopumā 3. grupas dzīvniekiem arī brūces izmērs samazinājās, bet brūces malas palika iedragātas.

Tādējādi salīdzinošā pētījumā par brūču dzīšanas ātrumu, izmantojot fibroblastiem līdzīgas mezenhimālās cilmes šūnas un embrionālos fibroblastus, kā arī bez šūnu terapijas izmantošanas, tika atzīmēts apdeguma virsmas dzīšanas ātruma paātrinājums fibroblastiem līdzīgu mezenhimālo cilmes šūnu un embrionālo fibroblastu transplantācijas rezultātā. Tomēr, izmantojot allogēnas fibroblastiem līdzīgas mezenhimālās cilmes šūnas, brūču dzīšanas ātrums bija augstāks nekā pēc embrionālo fibroblastu transplantācijas. Tas izpaudās reģenerācijas procesa fāžu maiņas paātrinājumā - samazinājās šūnu infiltrācijas laiks, palielinājās asinsvadu tīkla augšanas ātrums, kā arī granulācijas audu veidošanās.

Dinamiskās planimetrijas rezultāti liecina, ka apdeguma brūces spontānas dzīšanas ātrums (neizmantojot šūnu terapiju) bija viszemākais. 15. un 30. dienā pēc alogēnu fibroblastiem līdzīgu mezenhimālo cilmes šūnu transplantācijas brūču dzīšanas ātrums bija augstāks nekā pēc embrionālo fibroblastu transplantācijas. Histoķīmiskā beta-galaktozidāzes noteikšanas metode parādīja, ka pēc fibroblastiem līdzīgu mezenhimālo cilmes šūnu un embrionālo fibroblastu transplantācijas transplantētās šūnas saglabājas dzīvotspējīgas gan reģenerējošo brūču virsmā, gan dziļumā visā novērošanas periodā. Autori uzskata, ka augstāks apdeguma brūču reģenerācijas ātrums, izmantojot fibroblastiem līdzīgas mezenhimālās cilmes šūnas, ir saistīts ar bioloģiski aktīvo augšanu stimulējošo faktoru izdalīšanos no šīm šūnām nobriešanas procesā.

Klīniskajā praksē apdegumu brūču ārstēšanai tiek izmantota arī auto- vai allogēnu keratinocītu un allogēnu fibroblastu transplantācija. Jāatzīmē, ka bērnu ķirurģiska ārstēšana ar plašiem dziļiem apdegumiem ir sarežģīts uzdevums, ņemot vērā to augsto traumatisko raksturu un daudzkārtējo ķirurģisko iejaukšanos, ievērojamo asins zudumu un dažādas reakcijas uz izmantotajiem infūzijas līdzekļiem. Galvenās grūtības, veicot ādas plastiskās operācijas plašiem dziļiem apdegumiem, kuru platība pārsniedz 40% no ķermeņa virsmas, ir saistītas ar cietušo stāvokļa smagumu un donoru ādas resursu trūkumu. Tīkla transplantātu ar augstu perforācijas koeficientu izmantošana problēmu neatrisina, jo pēc perforācijas izveidojušās šūnas epitēlizējas ļoti lēni, un paši ādas atloki bieži lizējas vai izžūst. Šādi apdegumu brūču pārklājumi kā ksenozīns, līķu allotransplantāti, sintētiskās plēves pārklājumi ne vienmēr ir pietiekami efektīvi, tāpēc tiek izstrādātas jaunas metodes apdegumu virsmu pārklāšanai ar kultivētu keratinocītu un fibroblastu slāņiem. Jo īpaši ir ierosināta metode apdegumu virsmu pārklāšanai ar kultivētu alofibroblastu palīdzību, kuriem transplantējot ir izteikta stimulējoša ietekme uz epidermocītu, kas saglabājušies brūcē robežapdegumu gadījumā, kā arī keratinocītu proliferāciju tīklveida transplantātu starpsienās. L. Budkevičas un līdzautoru darbs (2000) atspoguļo šīs metodes izmantošanas rezultātus apdegumu ārstēšanā bērniem. Pētījumā piedalījās 31 bērns ar termisku traumu vecumā no 1 gada līdz 14 gadiem. Trijiem bērniem IIIA-B - IV pakāpes apdegumu brūču kopējā platība bija 40%, 25 bērniem - 50-70%, vēl trim bērniem - 71-85% no ķermeņa virsmas. Agrīna ķirurģiska nekrektomija tika apvienota ar kultivētu alofibroblastu transplantāciju un autodermoplastiku. Pirmajā ārstēšanas posmā tika izņemti nekrotisko audu audu audumi, otrajā posmā - kultivētu alofibroblastu transplantācija uz nesējplēvēm, bet trešajā posmā (48 stundas pēc kultivētu alofibroblastu transplantācijas) tika noņemta matrice un veikta autodermoplastika ar ādas atlokiem ar perforācijas attiecību 1:4. Trijiem pacientiem, kuri tika uzņemti klīnikā ar smagu apdegumu slimību, kultivētie alofibroblasti tika transplantēti uz granulējošām brūcēm. Kultivētu alofibroblastu transplantācija tika veikta vienu reizi 18 bērniem, divas reizes 11 bērniem un trīs reizes diviem pacientiem. Ar šūnu kultūru pārklātās brūces virsmas laukums svārstījās no 30 līdz 3500 cm2. Kultivētu alofibroblastu efektivitāte tika novērtēta pēc kopējā ādas transplantāta iesakņošanās procentuālā daudzuma, apdegumu dzīšanas laika un letālo gadījumu skaita no smagas termiskas traumas. Transplantāts bija pilnībā iesakņojies 86% pacientu. Daļēja ādas transplantātu neiesakņošanās tika novērota 14% gadījumu. Neskatoties uz ārstēšanu, seši (19,3%) bērni nomira. Kopējais ādas bojājumu laukums tajos svārstījās no 40 līdz 70% no ķermeņa virsmas.Kultivētu alofibroblastu transplantācija nevienam pacientam nebija saistīta ar mirstību apdegumu gadījumā.

Analizējot ārstēšanas rezultātus, autori norāda, ka iepriekš dziļi termiski ādas bojājumi, kas klāja 35–40% no ķermeņa virsmas, tika uzskatīti par nesavienojamiem ar dzīvību (mazākiem bērniem – līdz 3 gadu vecumam – kritiski ir dziļi apdegumi, kas klāj 30% no ķermeņa virsmas, vecākiem bērniem – vairāk nekā 40% no ķermeņa virsmas). Veicot ķirurģisku nekrektomiju ar kultivētu alofibroblastu transplantāciju un sekojošu autodermoplastiku ar ādas atlokiem ar augstu perforācijas koeficientu, IIIB–IV pakāpes apdegumi joprojām ir kritiski, taču pašlaik daudzos gadījumos pastāv perspektīvas glābt pat šādu upuru dzīvības. Ķirurģiska nekrektomija kombinācijā ar kultivētu alofibroblastu transplantāciju un autodermoplastiku bērniem ar dziļiem apdegumiem ir izrādījusies īpaši efektīva pacientiem ar plaši izplatītiem ādas bojājumiem, kuriem trūkst donoru vietu. Aktīva ķirurģiska taktika un kultivētu alofibroblastu transplantācija veicina šādu pacientu vispārējā stāvokļa ātru stabilizāciju, apdegumu slimības infekcijas komplikāciju skaita samazināšanos, labvēlīgu apstākļu radīšanu transplantātu iesakņošanai, zaudētās ādas atjaunošanas laika un stacionārās ārstēšanas ilguma samazināšanos, letālu iznākumu biežuma samazināšanos upuriem ar plašiem apdegumiem. Tādējādi kultivētu alofibroblastu transplantācija ar sekojošu autodermoplastiku ar ādas atlokiem ļauj atveseļoties bērniem ar smagiem apdegumiem, kuri iepriekš tika uzskatīti par lemtiem neveiksmei.

Ir vispārpieņemts, ka apdegumu slimības ārstēšanas galvenais mērķis ir pēc iespējas pilnīgāk un ātrāk atjaunot bojāto ādu, lai novērstu toksisku iedarbību, infekcijas komplikācijas un dehidratāciju. Kultivētu šūnu izmantošanas rezultāti lielā mērā ir atkarīgi no pašas apdeguma brūces gatavības transplantācijai. Kultivētu keratinocītu transplantācijas gadījumos uz brūces virsmas pēc ķirurģiskas nekrektomijas vidēji 55% (pēc laukuma) transplantēto šūnu iesakņojas, savukārt granulējošu brūču gadījumā iesakņošanās rādītājs samazinās līdz 15%. Tāpēc plašu dziļu ādas apdegumu veiksmīgai ārstēšanai, pirmkārt, ir nepieciešama aktīva ķirurģiska taktika. IIIB-IV pakāpes apdegumu brūču gadījumā apdeguma virsma tiek nekavējoties atbrīvota no nekrotiskajiem audiem, lai mazinātu intoksikāciju un samazinātu apdegumu slimības komplikāciju skaitu. Šādas taktikas izmantošana ir galvenais, lai samazinātu laiku no apdeguma gūšanas brīža līdz brūču aizvēršanai un pacientu ar plašiem apdegumiem uzturēšanās ilgumu slimnīcā, kā arī ievērojami samazina letālu iznākumu skaitu.

Pirmie ziņojumi par veiksmīgu kultivētu keratinocītu izmantošanu apdegumu virsmu pārklāšanai parādījās 20. gs. astoņdesmito gadu sākumā. Pēc tam šī manipulācija tika veikta, izmantojot kultivētu keratinocītu slāņus, kas visbiežāk iegūti no autošūnām, daudz retāk no allokeratinocītiem. Tomēr autokeratinocitoplastikas tehnoloģija neļauj izveidot šūnu banku, savukārt pietiekama laukuma keratinocītu transplantāta izgatavošanai nepieciešamais laiks ir ilgs un sasniedz 3–4 nedēļas. Šajā periodā strauji palielinās apdegumu slimības infekcijas un citu komplikāciju attīstības risks, kas ievērojami pagarina kopējo pacientu uzturēšanās laiku slimnīcā. Turklāt autokeratinocīti praktiski neiesakņojas, transplantējot tos uz granulējošām apdegumu brūcēm, un speciālo augšanas barotņu un bioloģiski aktīvo keratinocītu augšanas stimulatoru augstās izmaksas ievērojami ierobežo to klīnisko izmantošanu. Citas biotehnoloģiskās metodes, piemēram, kolagēnoplastika, kriokonservēta ksenozīna transplantācija un dažādu biopolimēru pārklājumu izmantošana, palielina plašu virspusēju, bet ne dziļu apdegumu ārstēšanas efektivitāti. Brūces virsmas pārklāšanas metode ar kultivētiem fibroblastiem būtiski atšķiras, jo par kultivētā šūnu slāņa galveno sastāvdaļu tiek izmantoti fibroblasti, nevis keratinocīti.

Metodes izstrādes priekšnoteikums bija dati, ka pericīti, kas ieskauj mazos asinsvadus, ir mezenhimālās cilmes šūnas, kas spēj pārveidoties par fibroblastiem, kuri ražo daudzus augšanas faktorus un nodrošina brūču dzīšanu, pateicoties spēcīgai stimulējošai iedarbībai uz keratinocītu proliferāciju un adhēziju. Kultivētu fibroblastu izmantošana brūču virsmu slēgšanai nekavējoties atklāja vairākas būtiskas šīs metodes priekšrocības salīdzinājumā ar kultivētu keratinocītu izmantošanu. Jo īpaši fibroblastu iegūšanai kultūrā nav nepieciešamas īpašas barības vielas un augšanas stimulatori, kas samazina transplantācijas izmaksas vairāk nekā 10 reizes, salīdzinot ar keratinocītu iegūšanas izmaksām. Fibroblasti viegli pasivējas, un šajā laikā tie daļēji zaudē virsmas histosaderības antigēnus, kas savukārt paver iespēju izmantot alogēnas šūnas transplantātu ražošanai un to banku izveidei. Laiks, kas nepieciešams, lai iegūtu transplantātus, kas ir gatavi lietošanai klīnikā, tiek samazināts no 3 nedēļām (keratinocītiem) līdz 1-2 dienām (fibroblastiem). Primāro fibroblastu kultūru var iegūt, kultivējot šūnas no ādas fragmentiem, kas ņemti autodermoplastikas laikā, un šūnu sēšanas blīvums cilvēka fibroblastu subkultūru iegūšanai ir tikai 20 x 103 ^uz 1 ^cm2.

Lai pētītu fibroblastu un to regulējošo proteīnu ietekmi uz keratinocītu proliferāciju un diferenciāciju, tika veikta keratinocītu morfoloģijas un proliferācijas salīdzinošā analīze uz I un III tipa kolagēna substrātiem, kā arī fibronektīna kopīgā kultūrā ar cilvēka fibroblastiem. Cilvēka keratinocīti tika izolēti no pacientu ar apdegumiem ādas fragmentiem, kas ņemti autodermoplastikas laikā. Keratinocītu sēšanas blīvums bija 50 x 103 šūnas uz 1 cm2. Kultivētas fibroblastu transplantācijas klīniskā efektivitāte tika novērtēta 517 pacientiem. Visi pacienti tika iedalīti divās grupās: 1. grupa - pieaugušie cietušie ar IIA, B - IV pakāpes apdegumiem; 2. grupa - bērni ar dziļiem IIIB - IV pakāpes apdegumiem. Vienslāņa kultūras fibroblastu strukturālās un funkcionālās organizācijas dinamikas novērtējums, ņemot vērā glikozaminoglikānu, fibronektīna un kolagēna lomu reģenerācijas procesos, ļāva autoriem noteikt 3. dienu kā vislabvēlīgāko periodu fibroblastu kultūru izmantošanai transplantāciju veikšanai. Pētījums par fibroblastu ietekmi uz keratinocītu proliferāciju un diferenciāciju parādīja, ka in vitro fibroblastiem ir izteikta stimulējoša iedarbība, galvenokārt uz keratinocītu adhēzijas procesiem, palielinot piesaistīto šūnu skaitu un to fiksācijas ātrumu vairāk nekā 2 reizes. Adhēzijas procesu stimulēšanu pavada DNS sintēzes intensitātes un keratinocītu proliferācijas līmeņa palielināšanās. Turklāt izrādījās, ka fibroblastu un to veidotās ārpusšūnu matricas klātbūtne ir nepieciešams nosacījums keratinocītu tonofibrilārā aparāta veidošanai, starpšūnu savienojumiem un, galu galā, keratinocītu diferenciācijai un bazālās membrānas veidošanai. Ārstējot bērnus ar dziļiem apdegumiem, ir noteikta augsta alofibroblastu kultūras transplantācijas klīniskā efektivitāte, īpaši pacientu grupā ar plašiem ādas bojājumiem donora vietas deficīta apstākļos. Visaptverošs morfofunkcionāls pētījums parādīja, ka transplantācijas fibroblastiem raksturīga aktīva DNS, kā arī kolagēna, fibronektīna un glikozaminoglikānu sintēze, kas ir daļa no šūnu veidotās ārpusšūnu matricas. Autori norāda uz transplantēto fibroblastu augsto iesakņošanās procentuālo daļu (līdz 96%), strauju to saņemšanas laika samazināšanos (24–48 stundu laikā, nevis 2–3 nedēļu laikā keratinocītu lietošanas gadījumā), ievērojamu apdeguma virsmas epitelizācijas paātrināšanos, kā arī ievērojamu transplantāta audzēšanas no fibroblastiem tehnoloģijas izmaksu samazinājumu (10 reizes) salīdzinājumā ar keratinocītu transplantāciju. Kultivētu alofibroblastu transplantācijas izmantošana ļauj glābt bērnu dzīvības ar kritiskiem apdegumiem – termiskiem bojājumiem vairāk nekā 50% ķermeņa virsmas.kas iepriekš tika uzskatīts par nesavienojamu ar dzīvību. Jāatzīmē, ka ar alogēnu embrionālo fibroblastu transplantāciju ir pārliecinoši pierādīta ne tikai ātrāka brūču reģenerācija un pacientu ar dažādas pakāpes un apdegumu zonām atveseļošanās, bet arī ievērojama viņu mirstības samazināšanās.

Autologi fibroblasti tiek izmantoti arī tādā sarežģītā plastiskās ķirurģijas jomā kā balss saišu traumu rekonstruktīvā korekcija. Šim nolūkam parasti izmanto liellopu kolagēnu, kura darbības ilgumu ierobežo tā imunogenitāte. Būdams svešs proteīns, liellopu kolagēns ir jutīgs pret recipienta kolagenāzi un var izraisīt imūnreakcijas, kuru riska samazināšanai tika izstrādātas tehnoloģijas kolagēna preparātu iegūšanai, kas ir šķērssaistīti ar glutaraldehīdu. To priekšrocība ir lielāka stabilitāte un zemāka imunogenitāte, kas ir atradusi praktisku pielietojumu balss saišu defektu un atrofijas novēršanā. Autologa kolagēna injekcijas pirmo reizi tika izmantotas 1995. gadā. Šī metode nodrošināja autologu kolagēna šķiedru primārās struktūras saglabāšanu, tostarp intramolekulāri fermentatīvi katalizētas šķērssaites. Fakts ir tāds, ka dabiskās kolagēna šķiedras ir izturīgākas pret proteāžu izraisītu iznīcināšanu nekā rekombinētais kolagēns, kurā telopeptīdi ir pārgriezti. Telopeptīdu integritāte ir svarīga kolagēna šķiedru kvaternārajai struktūrai un šķērssaišu veidošanai starp blakus esošajām kolagēna molekulām. Atšķirībā no liellopu kolagēna preparātiem, autologs kolagēns neizraisa recipientam imūnreakcijas, taču tas nav pietiekami efektīvs kā atjaunojošs līdzeklis. Stabilu korekciju var panākt, lokāli ražojot kolagēnu, transplantējot autologus fibroblastus. Tomēr, pētot autologas fibroblastu transplantācijas efektivitāti klīnikā, tika konstatētas zināmas grūtības. Agrīnā periodā pēc fibroblastu transplantācijas klīniskais efekts bija vājāks salīdzinājumā ar to, kas bija pēc liellopu kolagēna ieviešanas. Kultivējot autologus fibroblastus, nevar izslēgt normālu fibroblastu transformācijas iespēju par patoloģiskiem, tā sauktajiem miofibroblastiem, kas ir atbildīgi par fibrozes attīstību un rētu veidošanos, ko apliecina kolagēna gēla kontrakcija, ko izraisa fibroblastu un kolagēna fibrilu specifiskā mijiedarbība. Turklāt pēc secīgas pasāžas in vitro fibroblasti zaudē spēju sintezēt ekstracelulārās matrices proteīnus.

Tomēr tagad eksperimentāli ir izstrādāta autologu cilvēka fibroblastu kultivēšanas metode, kas novērš iepriekš minētos trūkumus un neizraisa normālu fibroblastu onkogēnu transformāciju. Ar šo metodi iegūtie autologie fibroblasti tiek izmantoti, lai atjaunotu defektus mīkstajos sejas audos. G. Kellera u.c. (2000) pētījumā tika ārstēti 20 pacienti vecumā no 37 līdz 61 gadam ar grumbām un atrofiskām rētām. Ādas biopsijas (4 mm) no retroaurikulārā apgabala tika transportētas uz laboratoriju sterilās mēģenēs, kas saturēja 10 ml barotnes (Īgla barotne ar antibiotiku, mikoseptiku, piruvātu un teļa fetālo serumu). Materiāls tika ievietots 3-5 kultivēšanas trauciņos ar 60 mm diametru un inkubēts termostatā ar atmosfēru, kas satur 5% CO2. Pēc 1 nedēļas šūnas tika izņemtas no trauciņiem ar tripsinizāciju un ievietotas 25 cm2 flakonos. Šūnas pacientiem tika injicētas 4 x 10⁻⁷ daudzumā. Nozīmīgs un noturīgs klīniskais efekts tika novērots pacientiem nazolabiālo kroku korekcijas laikā, kā arī pacientiem ar rētām 7 un 12 mēnešus pēc trešās autologo fibroblastu transplantācijas. Saskaņā ar plūsmas citometriju kultivētie fibroblasti saražoja lielu daudzumu I tipa kolagēna. In vitro pētījumi ir uzrādījuši injicēto fibroblastu normālu kontraktilitāti. Divus mēnešus pēc kultivētu fibroblastu subkutānas ievadīšanas 4 x 10⁻⁷ šūnu devā kailām pelēm audzēji netika atklāti. Injicētie fibroblasti pacientiem neizraisīja rētas vai difūzu fibrozi. Pēc autora domām, transplantētie autologie fibroblasti spēj pastāvīgi ražot kolagēnu, kas nodrošinās kosmētisku atjaunojošu efektu. Tajā pašā laikā, tā kā diferencētu šūnu dzīves ilgums ir ierobežots, no jauna pacienta ņemtie fibroblasti ir efektīvāki nekā tie, kas iegūti no vecāka gadagājuma cilvēkiem. Nākotnē tiek pieņemts, ka būs iespējams kriokonservēt no jauna donora ņemtu fibroblastu kultūru, lai vēlāk transplantētu viņa paša jaunās šūnas vecāka gadagājuma pacientam. Noslēgumā jāsecina, ka autologi fibroblasti, ja tie ir funkcionāli saglabāti, nav pilnīgi pareizi, ir ideāls līdzeklis sejas mīksto audu defektu korekcijai. Vienlaikus pats autors norāda, ka pētījuma laikā radās dažas problemātiskas situācijas, kas saistītas ar autologas fibroblastu-kolagēna sistēmas lietošanu. Klīniskais efekts bieži vien bija vājāks nekā lietojot liellopu kolagēnu, kas pacientiem radīja vilšanos.

Kopumā literatūras dati par mezenhimālo cilmes šūnu klīniskās izmantošanas perspektīvām izskatās diezgan optimistiski. Tiek mēģināts izmantot autologas kaulu smadzeņu multipotentas mezenhimālās cilmes šūnas deģeneratīvu locītavu bojājumu ārstēšanai. Tiek veikti pirmie klīniskie pētījumi par kultivētu mezenhimālo cilmes šūnu izmantošanu sarežģītu kaulu lūzumu ārstēšanā. Auto- un allogēnas mezenhimālās kaulu smadzeņu stromas šūnas tiek izmantotas, lai izveidotu skrimšļa audus transplantācijai locītavu skrimšļa defektu korekcijai traumas vai autoimūnu bojājumu dēļ. Tiek izstrādātas metodes multipotentu mezenhimālo cilmes šūnu klīniskai izmantošanai, lai novērstu kaulu defektus bērniem ar smagu nepilnīgas osteoģenēzes formu, ko izraisa mutācijas I tipa kolagēna gēnā. Pēc mieloablācijas recipientiem bērniem tiek transplantētas kaulu smadzenes no HLA saderīgiem veseliem donoriem, jo nefrakcionētas kaulu smadzenes var saturēt pietiekamu skaitu mezenhimālo cilmes šūnu, lai kompensētu smagu kaulu defektu. Pēc allogēnu kaulu smadzeņu transplantācijas šādiem bērniem ir novērotas pozitīvas histoloģiskas izmaiņas trabekulārajos kaulos, augšanas ātruma palielināšanās un kaulu lūzumu biežuma samazināšanās. Dažos gadījumos pozitīvs klīniskais rezultāts tiek panākts, transplantējot cieši radniecīgas allogēnas kaulu smadzenes un osteoblastus. MSC transplantāciju izmanto arī iedzimta kaulu trausluma ārstēšanai, ko izraisa osteoblastu un osteoklastu nelīdzsvarotība kaulu audos. Šajā gadījumā kaulu veidošanās atjaunošana tiek panākta, himerizējot pacientu kaulu audos esošo cilmes un cilmes stromas šūnu kopumu.

Tiek turpināta donoru mezenhimālo cilmes šūnu ģenētiskās modifikācijas metožu uzlabošana, lai koriģētu stromas audu ģenētiskos defektus. Tiek pieņemts, ka tuvākajā nākotnē mezenhimālās cilmes šūnas tiks izmantotas neiroloģijā mērķtiecīgai smadzeņu šūnu himerizācijai un veselīgu šūnu kopuma izveidei, kas spēj ģenerēt deficītu enzīmu vai faktoru, kas ir atbildīgs par slimības klīniskajām izpausmēm. Mezenhimālo cilmes šūnu transplantāciju var izmantot kaulu smadzeņu stromas atjaunošanai vēža pacientiem pēc staru un ķīmijterapijas, un kombinācijā ar kaulu smadzeņu šūnām - hematopoēzes atjaunošanai. Aizvietojošās terapijas izstrādi, kuras mērķis ir novērst muskuļu un skeleta sistēmas defektus ar MSC palīdzību, veicina inženiertehniskie sasniegumi matricveida biomateriālu vai biomimētiku projektēšanas jomā, veidojot karkasus, ko apdzīvo mezenhimālo cilmes šūnu pēcnācēji.

Mezenhimālo cilmes šūnu avoti

Mezenhimālo cilmes šūnu galvenais avots ir kaulu smadzenes, kuru hematopoētiskās cilmes šūnas zīdītāju organismā pastāvīgi diferencējas par asins un imūnsistēmas šūnām, savukārt mezenhimālās cilmes šūnas pārstāv neliela fibroblastiem līdzīgu kaulu smadzeņu stromas šūnu populācija, un tās veicina hematopoētisko cilmes šūnu nediferencētā stāvokļa saglabāšanu. Noteiktos apstākļos mezenhimālās cilmes šūnas diferencējas par skrimšļa un kaulu audu šūnām. Iesējot barotnē zema blīvuma stādīšanas apstākļos, kaulu smadzeņu mononukleārās stromas šūnas veido adhezīvo šūnu kolonijas, kas faktiski ir fibroblastiem līdzīgas multipotentas mezenhimālās cilmes šūnas. Daži autori uzskata, ka kaulu smadzenēs nogulsnējas nesaistītas mezenhimālās cilmes šūnas, kas, pateicoties to spējai pašatjaunoties un augstajam diferenciācijas potenciālam, nodrošina visus ķermeņa audus ar mezenhimāliem stromas elementu prekursoriem visā zīdītāja organisma dzīves laikā.

Kaulu smadzenēs stromas šūnu elementi veido tīklu, kas aizpilda telpu starp sinusoīdiem un kaulaudiem. Pieauguša cilvēka kaulu smadzenēs snaudošo MSC saturs ir salīdzināms ar hematopoētisko cilmes šūnu daudzumu un nepārsniedz 0,01–0,001%. No kaulu smadzenēm izolētām un nekultivētām mezenhīmajām cilmes šūnām nav adhēzijas molekulu. Šādas MSC neizpauž CD34, ICAM, VCAM, I un III tipa kolagēnu, CD44 un CD29. Līdz ar to in vitro uz kultūras substrāta netiek fiksētas mezenhimālās cilmes šūnas, bet gan attīstītāki mezenhimālo cilmes šūnu cilmes šūnu cilmes šūnu cilmes šūnu atvasinājumi, kas jau ir izveidojuši citoskeleta un šūnu adhēzijas molekulu receptoru aparāta komponentus. Stromas šūnas ar CD34 fenotipu ir atrodamas pat perifērajās asinīs, lai gan kaulu smadzenēs to ir ievērojami mazāk nekā CD34-pozitīvu mononukleāro šūnu. No asinīm izolētas un kultūrā pārnestas CD34 šūnas piestiprinās substrātam un veido fibroblastiem līdzīgu šūnu kolonijas.

Ir zināms, ka embrionālajā periodā visu zīdītāju un cilvēku orgānu un audu stromas pamats rodas no kopīga mezenhimālo cilmes šūnu kopuma pirms un organoģenēzes stadijā. Tāpēc tiek uzskatīts, ka nobriedušā organismā lielākajai daļai mezenhimālo cilmes šūnu jāatrodas saistaudos un kaulu audos. Ir noskaidrots, ka lielāko daļu no irdeno saistaudu un kaulu audu stromas šūnu elementiem pārstāv specializētas cilmes šūnas, kuras tomēr saglabā spēju vairoties un veidot klonus in vitro. Kad šādas šūnas tiek ievadītas vispārējā asinsritē, vairāk nekā 20% mezenhimālo cilmes šūnu tiek implantētas starp hematopoētisko audu un parenhimatozo orgānu stromas elementiem.

Potenciāls mezenhimālo cilmes šūnu avots ir taukaudi, starp kuru cilmes šūnām ir identificēti dažādās pakāpēs iesaistīti adipocītu prekursori. Vismazāk nobriedušie taukaudu cilmes elementi ir stromas-vaskulārās šūnas, kas, tāpat kā kaulu smadzeņu multipotentās mezenhimālās prekursoršūnas, glikokortikoīdu, insulīnam līdzīgā augšanas faktora un insulīna ietekmē spēj diferencēties par adipocītiem. Kultūrā stromas-vaskulārās šūnas diferencējas par adipocītiem un hondrocītiem, un kaulu smadzeņu izcelsmes taukaudos ir šūnas, kas veido adipocītus un osteoblastus.

Stromas cilmes šūnas ir atrastas arī muskuļos. No cilvēka skeleta muskuļiem izolētu šūnu primārajā kultūrā tiek atklātas stellātu šūnas un daudzkodolu miotubulas. Zirga seruma klātbūtnē stellātu šūnas in vitro proliferējas bez citodiferenciācijas pazīmēm, un pēc deksametazona pievienošanas barības vielai to diferenciāciju raksturo šūnu elementu parādīšanās ar skeleta un gludo muskuļu šūnu, kaulu, skrimšļu un taukaudu fenotipu. Tādēļ cilvēka muskuļu audos ir gan piesaistītas, gan nesaistītas multipotentas mezenhimālās cilmes šūnas. Ir pierādīts, ka skeleta muskuļos esošo cilmes šūnu populācija rodas no nesaistītām multipotentām kaulu smadzeņu mezenhimālajām cilmes šūnām un atšķiras no miogēnām satelītšūnām.

Jaundzimušu žurku miokardā tika atrastas arī adhezīvās stellātu šūnas, kas atbilst multipotentām mezenhimālām cilmes šūnām ar diferenciācijas potenciālu, jo deksametazona ietekmē tās diferencējas par adipocītiem, osteoblastiem, hondrocītiem, gludo muskuļu šūnām, skeleta muskuļu miotubulām un kardiomiocītiem. Tika pierādīts, ka asinsvadu gludo muskuļu šūnas (pericīti) ir nediferencētu perivaskulāru multipotentu mezenhimālo cilmes šūnu atvasinājumi. Kultūrā perivaskulāras mezenhimālās cilmes šūnas ekspresē gludo muskuļu α-aktīnu un trombocītu augšanas faktora receptoru un spēj diferencēties vismaz par gludo muskuļu šūnām.

Īpašu vietu no stumbra rezervju viedokļa ieņem skrimšļa audi, kuru ārkārtīgi zemais reparatīvais potenciāls, domājams, ir saistīts ar multipotentu mezenhimālo cilmes šūnu vai diferenciācijas un augšanas faktoru deficītu. Tiek pieņemts, ka multipotentās mezenhimālās cilmes šūnas, kas iepriekš paredzētas hondro- un osteoģenēzei, nonāk skrimšļa audos no citiem audu avotiem.

Mezenhimālo cilmes šūnu audu izcelsme un saistīšanās apstākļi cīpslās arī nav noskaidroti. Eksperimentāli novērojumi liecina, ka agrīnā postnatālajā periodā trušu Ahilleja cīpslas šūnas primārajās kultūrās un pirmajā pasāžā saglabā I tipa kolagēna un dekorīna ekspresiju, bet tālākas kultivēšanas laikā tās zaudē tenocītu diferenciācijas marķierus.

Jāatzīmē, ka atbilde uz jautājumu, vai dažādos audos lokalizētas multipotentas mezenhimālās cilmes šūnas faktiski pastāvīgi atrodas to stromā, vai mezenhimālo cilmes šūnu audu kopums tiek papildināts ar kaulu smadzeņu stromas cilmes šūnu migrāciju, vēl nav saņemta.

Papildus kaulu smadzenēm un citām pieauguša organisma mezenhimālajām audu zonām, nabassaites asinis var būt vēl viens MSC avots. Ir pierādīts, ka nabassaites vēnu asinīs ir šūnas, kurām ir līdzīgas morfoloģiskās un antigēniskās īpašības ar multipotentām mezenhimālajām cilmes šūnām, tās spēj adhēziju un diferenciācijas potenciāla ziņā nav sliktākas par kaulu smadzeņu izcelsmes multipotentām mezenhimālajām cilmes šūnām. Nabassaites asiņu mezenhimālo cilmes šūnu kultūrās tika atrastas 5 līdz 10% nesaistītu multipotentu mezenhimālo cilmes šūnu. Izrādījās, ka to skaits nabassaites asinīs ir apgriezti proporcionāls gestācijas vecumam, kas netieši norāda uz multipotentu mezenhimālo cilmes šūnu migrāciju uz dažādiem audiem augļa attīstības laikā. Ir parādījusies pirmā informācija par no nabassaites asinīm izolētu mezenhimālo cilmes šūnu, kā arī no embrionālā biomateriāla iegūtu mezenhimālo cilmes šūnu klīnisko izmantošanu, kas balstās uz zināmo augļa cilmes šūnu spēju integrēties, iesakņoties un funkcionēt pieauguša cilvēka orgānos un audu sistēmās.

Meklējiet jaunus mezenhimālo cilmes šūnu avotus

Embrionālas izcelsmes mezenhimālo cilmes šūnu, kā arī citu augļa šūnu izmantošana rada vairākas ētiskas, juridiskas, tiesiskas un likumdošanas problēmas. Tāpēc ekstraembrionāla donoru šūnu materiāla meklēšana turpinās. Mēģinājums klīniski izmantot cilvēka ādas fibroblastus bija neveiksmīgs, ko noteica ne tikai tehnoloģijas augstā finansiālā kapacitāte, bet arī fibroblastu straujā diferenciācija fibrocītos, kuriem ir ievērojami zemāks proliferācijas potenciāls un kuri ražo ierobežotu skaitu augšanas faktoru. Turpmāka attīstība MSC un kaulu smadzeņu multipotento mezenhimālo cilmes šūnu bioloģijas pētījumos ļāva izstrādāt autologu mezenhimālo cilmes šūnu klīniskās izmantošanas stratēģiju. To izolēšanas, kultivēšanas, ex vivo reprodukcijas un mērķtiecīgas diferenciācijas tehnoloģija, pirmkārt, prasīja MSC molekulāro marķieru spektra izpēti. To analīze parādīja, ka cilvēka kaulu audu primārajās kultūrās ir vairāki multipotentu mezenhimālo cilmes šūnu veidi. Proosteoblastu fenotips tika atklāts šūnās, kas ekspresē stromas cilmes šūnu marķieri STRO-1, bet nesatur osteoblastu marķieri - sārmaino fosfatāzi. Šādām šūnām raksturīga zema spēja veidot mineralizētu kaulu matricu, kā arī osteopontīna un parathormona receptoru ekspresijas neesamība. STRO-1 pozitīvu šūnu atvasinājumus, kas neizpauž sārmaino fosfatāzi, pārstāv starpposma un pilnīgas diferenciācijas osteoblasti. Tika konstatēts, ka STRO-1 pozitīvu cilvēka trabekulārā kaula šūnu klonēto līniju šūnu elementi spēj diferencēties nobriedušos osteocītos un adipocītos. Šo šūnu diferenciācijas virziens ir atkarīgs no polinepiesātināto taukskābju, proinflamatorisku citokīnu - IL-1b un audzēja nekrozes faktora a (TNF-α), kā arī pretiekaisuma un imūnsupresīvā TGF-b ietekmes.

Vēlāk tika atklāts, ka multipotentām mezenhimālajām cilmes šūnām trūkst specifiska fenotipa, kas raksturīgs tikai tām, bet tās ekspresē mezenhimālajām, endotēlija, epitēlija un muskuļu šūnām raksturīgu marķieru kompleksu, ja nav hematopoētisko šūnu imunofenotipisko antigēnu - CD45, CD34 un CD14 - ekspresijas. Turklāt mezenhimālās cilmes šūnas konstitutīvi un inducējami ražo hematopoētiskos un nehematopoētiskos augšanas faktorus, interleikīnus un hemokīnus, un uz multipotentām mezenhimālajām cilmes šūnām tiek ekspresēti dažu citokīnu un augšanas faktoru receptori. Cilvēka ķermeņa stromas matricas šūnās ir atrastas snaudošas jeb atpūtas šūnas ar imunofenotipu, kas ir gandrīz identisks ar 5-fluoruracilu neapstrādātu multipotentu mezenhimālo cilmes šūnu antigēna profilam - abas šūnas ekspresē CD117, kas iezīmē "pieaugušo" cilmes šūnas.

Tādējādi vēl nav identificēts šūnu marķieris, kas raksturīgs tikai mezenhimālajām cilmes šūnām. Tiek pieņemts, ka miera stāvokļa šūnas pārstāv nesaistītu multipotentu mezenhimālo cilmes šūnu populāciju, jo tās neizpauž šūnu marķierus, kas saistīti ar osteo- (Cbfa-1) vai adipoģenēzi (PPAR-y-2). Ilgstoša lēni proliferējošu miera stāvokļa šūnu pakļaušana augļa liellopu serumam noved pie termināli diferencētu saistītu cilmes šūnu veidošanās, kam raksturīga strauja augšana. Šādu mezenhimālo cilmes šūnu klonālo paplašināšanos atbalsta FGF2. Šķiet, ka stromas cilmes šūnu genoms ir diezgan cieši "slēgts". Ir ziņojumi par spontānas diferenciācijas neesamību MSC - bez īpašiem saistīšanās nosacījumiem tās netransformējas pat par mezenhimālās līnijas šūnām.

Lai pētītu mezenhimālo cilmes šūnu atvasinājumu populācijas struktūru, tiek veikta diferenciācijas marķieru proteīnu meklēšana stromas šūnu līnijās un primārajās kultūrās. Kaulu smadzeņu koloniju veidojošo šūnu in vitro klonālā analīze ir parādījusi, ka EGF, uzklājot uz primārajām kultūrām, palielina vidējo kolonijas lielumu un samazina sārmainās fosfatāzes klonālo ekspresiju, savukārt hidrokortizona pievienošana aktivizē sārmainās fosfatāzes ekspresiju, kas ir MSC diferenciācijas osteogēnā virziena marķieris. Monoklonālās antivielas pret STRO-1 ļāva atdalīt un pētīt STRO-1 pozitīvu adhēzijas šūnu populāciju heterogēnā Dekstera kultūru sistēmā. Ir noteikts citokīnu spektrs, kas regulē ne tikai hematopoētisko un limfoīdo šūnu proliferāciju un diferenciāciju, bet arī piedalās skeleta audu veidošanā, formēšanā un rezorbcijā, izmantojot para-, auto- un endokrīnus mehānismus. Receptoru mediēta tādu sekundāro kurjeru kā cAMP, diacilglicerīns, inozitola trifosfāts un Ca2+ izdalīšanās tiek izmantota arī dažādu kategoriju stromas audu šūnu, kas ekspresē atbilstošos receptorus, marķieru analīzei. Monoklonālo antivielu izmantošana kā marķieri ļāva noteikt limfoīdo orgānu stromas retikulāro šūnu piederību T un B atkarīgajām zonām.

Kādu laiku turpinājās zinātniskas debates par jautājumu par MSC izcelsmes iespējamību no hematopoētiskajām cilmes šūnām. Patiešām, kad kaulu smadzeņu šūnu suspensijas tiek ievietotas monoslāņa kultūrās, tajās aug atsevišķas fibroblastu kolonijas. Tomēr tika pierādīts, ka fibroblastu koloniju prekursoru un dažādu hematopoētisko audu diferenciācijas asnu klātbūtne kaulu smadzenēs neliecina par to kopīgu izcelsmi no hematopoētiskajām cilmes šūnām. Izmantojot kaulu smadzeņu cilmes šūnu diskriminantu analīzi, tika konstatēts, ka heterotopiskas kaulu smadzeņu transplantācijas laikā mikrovidi nepārnes hematopoētiskās šūnas, kas pierāda MSC populācijas esamību kaulu smadzenēs, kas ir histoģenētiski neatkarīga no hematopoētiskajām šūnām.

Turklāt selektīvā klonēšanas metode ļāva identificēt jaunu stromas cilmes šūnu kategoriju kaulu smadzeņu šūnu monoslāņa kultūrās, noteikt to skaitu un pētīt to īpašības, proliferācijas un diferenciācijas potenciālu. Izrādījās, ka stromas fibroblastiem līdzīgās šūnas proliferējas in vitro un veido diploīdas kolonijas, kas, transplantējot atpakaļ organismā, nodrošina jaunu hematopoētisko orgānu veidošanos. Atsevišķu klonu pētījumu rezultāti liecina, ka starp stromas cilmes šūnām ir šūnu populācija, kas pēc sava proliferācijas un diferenciācijas potenciāla var pretendēt uz stromas audu cilmes šūnu lomu, histoģenētiski neatkarīgas no hematopoētiskajām cilmes šūnām. Šīs populācijas šūnām raksturīga pašpietiekama augšana un tās diferencējas par kaulu, skrimšļu un kaulu smadzeņu retikulāro audu cilmes šūnu elementiem.

Lielu interesi rada R. Čailahjana un līdzautoru (1997.–2001. g.) pētījumu rezultāti, kuros trušiem, jūrascūciņām un pelēm kultivēja kaulu smadzeņu stromas cilmes šūnas uz a-MEM barotnes, pievienojot teļa fetāla serumu. Autori veica eksplantāciju ar sākotnējo blīvumu 2–4 x 103 kaulu smadzeņu šūnas uz 1 cm2. Kā barotava tika izmantotas homologas vai heterologas ar starojumu inaktivētas kaulu smadzeņu šūnas devā, kas saglabāja barotavas efektu, bet pilnībā bloķēja to proliferāciju. Divas nedēļas vecas primāras atsevišķas fibroblastu kolonijas tika tripsinizētas, lai iegūtu monoklonālus celmus. Pierādījumi par koloniju klonālo izcelsmi tika iegūti, izmantojot hromosomu marķieri jauktās jūrascūciņu tēviņu un mātīšu kaulu smadzeņu kultūrās, dzīvu kultūru laika intervāla fotografēšanu un CBA un CBAT6T6 peļu singenētisko kaulu smadzeņu jauktās kultūrās. Svaigi izolētu kaulu smadzeņu šūnu vai in vitro audzētu stromas fibroblastu suspensijas transplantācija zem nieru kapsulas tika veikta ivalona vai želatīna porainos karkasos, kā arī inaktivētā truša porainā kaula matricā. Klonu transplantācijai kaula apvalkā jūrascūciņu augšstilba kauli tika attīrīti no mīkstajiem audiem un periosta, epifīzes tika apgrieztas un kaulu smadzenes tika rūpīgi izskalotas. Kauls tika sagriezts fragmentos (3-5 mm), žāvēts un apstarots ar 60 Gy devu. Atsevišķas fibroblastu kolonijas tika ievietotas kaulu apvalkos un implantētas intramuskulāri. In vitro audzētu stromas fibroblastu intraperitoneālai transplantācijai tika izmantotas A tipa (V = 0,015 cm3, h = 0,1 mm) un O tipa (V = 0,15 cm3, h = 2 mm) difūzijas kameras.

Pētot klonālo celmu augšanas dinamiku, R. Čailakjans u.c. (2001) atklāja, ka atsevišķām šūnām, kas veido fibroblastu kolonijas, kā arī to pēcnācējiem ir milzīgs proliferācijas potenciāls. Līdz 10. pasāžai fibroblastu skaits dažos celmos bija 1,2–7,2 x 109 ^šūnas. Attīstības laikā tie veica līdz pat 31–34 šūnu dubultošanos. Šajā gadījumā no kaulu smadzenēm iegūtu celmu, kas veidoti no vairāku desmitu klonu stromas prekursoriem, heterotopiska transplantācija izraisīja kaulu smadzeņu mikrovides pārnesi un jauna hematopoētiskā orgāna veidošanos transplantācijas zonā. Autori uzdeva jautājumu, vai atsevišķi kloni spēj pārnest stromas šūnu kaulu smadzeņu mikrovidi, vai arī tam ir nepieciešama vairāku dažādu klonogēnu stromas prekursoru sadarbība? Un, ja atsevišķi kloni spēj pārnest mikrovidi, vai tā būs pilnīga visiem trim hematopoētiskajiem asniem, vai arī dažādi kloni nodrošina mikrovides veidošanos dažādiem hematopoētiskajiem asniem? Lai atrisinātu šīs problēmas, tika izstrādāta tehnoloģija stromas cilmes šūnu kultivēšanai uz kolagēna gela, kas ļauj izaudzētās fibroblastu kolonijas noņemt no virsmas turpmākai heterotopiskai transplantācijai. Atsevišķi no CBA peļu un jūrascūciņu kaulu smadzeņu šūnām izaudzēti stromas fibroblastu kloni tika izgriezti kopā ar gela pārklājuma fragmentu un heterotopiski transplantēti - zem singenētisku peļu nieru kapsulas vai autologu jūrascūciņu vēdera muskulī. Transplantējot muskulī, kolonijas uz gela tika ievietotas kaulu apvalkos.

Autori atklāja, ka 50–90 dienas pēc kaulu smadzeņu fibroblastu koloniju transplantācijas 20% gadījumu transplantācijas zonā tika novērota kaula vai kaula un hematopoētisko audu attīstība. 5% recipientu dzīvnieku izveidojušies kaulu audu perēkļi saturēja dobumu, kas piepildīts ar kaulu smadzenēm. Kaulu cilindru iekšpusē šādiem perēkļiem bija noapaļota forma un kapsula, kas veidota no kaulu audiem ar osteocītiem un labi attīstītu osteoblastisku slāni. Kaulu smadzeņu dobumā atradās retikulāri audi ar mieloīdām un eritroīdām šūnām, kuru proporcionālā attiecība neatšķīrās no normālām kaulu smadzenēm. Nierēs transplantāts bija tipisks kaulu smadzeņu orgāns, kas izveidojies dabisko kaulu smadzeņu transplantācijas laikā, kaula kapsulai nosedzot kaulu smadzeņu dobumu tikai no nieru kapsulas puses. Hematopoētiskajos audos bija mieloīdi, eritroīdi un megakariocītu elementi. Kaulu smadzeņu dobuma stromā bija labi attīstīta sinusa sistēma un tipiskas tauku šūnas. Tajā pašā laikā dažu koloniju transplantācijas zonā zem nieru kapsulas tika atrasti kaulu audi bez hematopoēzes pazīmēm. Atsevišķu klonu proliferācijas un diferenciācijas potenciāla izpēte tika turpināta ar trušu monoklonālām kaulu smadzeņu celmiem, kuru šūnas tika resuspendētas barības vielu vidē un atsevišķā ivalona sūklī ar masu 1-2 mg tika transplantētas zem truša kaulu smadzeņu donora nieru kapsulas. Šādai autotransplantācijai tika pakļautas 21 monoklonālā celma šūnas. Rezultāti tika ņemti vērā pēc 2-3 mēnešiem. Autori konstatēja, ka 14% gadījumu transplantētie monoklonālie celmi veidoja kaulu smadzeņu orgānu, kas sastāv no kaulu audiem un kaulu smadzeņu dobuma, kas piepildīts ar hematopoētiskām šūnām. 33% gadījumu transplantētie celmi veidoja kompaktu dažāda izmēra kaulu ar dobumos iemūrētiem osteocītiem un attīstītu osteoblastisku slāni. Dažos gadījumos sūkļos ar transplantētiem kloniem attīstījās retikulāri audi bez kaula vai hematopoētiskiem elementiem. Dažreiz izveidojās retikulāra stroma ar labi attīstītu sinusoīdu tīklu, bet nebija apdzīvota ar hematopoētiskām šūnām. Tādējādi iegūtie rezultāti bija līdzīgi datiem, kas iegūti klonu transplantācijas laikā uz kolagēna gela. Tomēr, ja uz substrāta audzētu klonu transplantācija izraisīja kaulu smadzeņu audu veidošanos 5% gadījumu, kaulu audu veidošanos 15% gadījumu un retikulāru audu veidošanos 80% gadījumu, tad monoklonālo celmu transplantācijas gadījumā kaulu smadzeņu elementu veidošanās tika novērota 14% gadījumu, kaulu audu veidošanos 53% gadījumu un retikulāru audu veidošanos 53% gadījumu. Pēc autoru domām, tas norāda, ka stromas fibroblastu proliferatīvā un diferenciācijas potenciāla īstenošanas apstākļi transplantācijas laikā uz porainiem karkasiem bija optimālāki nekā to transplantācijas laikā kaulu apvalkos un uz kolagēna substrāta.Iespējams, ka, izmantojot modernākas klonu kultivēšanas un reversās transplantācijas metodes, var uzlabot apstākļus to diferenciācijas potenciāla realizēšanai klonos un mainīt šīs attiecības. Vienā vai otrā veidā, taču veikto pētījumu galvenā nozīme ir tā, ka daži stromas šūnu kloni spēj veidot kaulu audus un vienlaikus nodrošināt stromas hematopoētisko mikrovidi trim kaulu smadzeņu hematopoēzes dzinumiem vienlaikus: eritroīdajam, mieloīdajam un megakariocītiskajam, radot diezgan lielas hematopoētisko audu un zināmas kaulu masas platformas.

Pēc tam autori pievērsās jautājumam par atsevišķu klonogēnu stromas cilmes šūnu spēju veikt šāda veida šūnu diferenciāciju slēgtā difūzijas kameru sistēmā. Turklāt bija jānosaka, vai atsevišķiem kloniem piemīt polipotence vai arī diferenciācijas potenciāla izpausmei ir nepieciešama vairāku klonu ar fiksētu citodiferenciācijas pazīmi kooperatīva mijiedarbība, kuru dažādās attiecības nosaka priekšroku kaulu, retikulāru vai skrimšļaudu veidošanās procesam. Apvienojot divas metodoloģiskas pieejas - kaulu smadzeņu stromas cilmes šūnu monoklonālo celmu iegūšanu un to transplantāciju difūzijas kamerās -, R. Čailahjans un līdzautori (2001) ieguva rezultātus, kas ļāva viņiem pietuvoties kaulu smadzeņu stromas strukturālās organizācijas izpratnei. Stromas cilmes šūnu monoklonālo celmu transplantācija O tipa kamerās izraisīja gan kaulu, gan skrimšļa audu veidošanos, kas norāda uz vienas stromas koloniju veidojošās šūnas pēcteču spēju vienlaikus veidot kaulu un skrimšļa audus. Pieņēmums, ka kaulu un skrimšļa audi rodas no kopīgas stromas cilmes šūnas, ir atkārtoti izvirzīts. Tomēr šai hipotēzei nebija pareiza eksperimentāla apstiprinājuma. Kaula un skrimšļa veidošanās difūzijas kamerās bija nepieciešamais pierādījums tam, ka starp kaulu smadzeņu stromas cilmes šūnām pastāv kopīga cilmes šūna šiem diviem audu veidiem.

Pēc tam difūzijas kamerās tika ievietoti 29 klonālie celmi no trušu kaulu smadzeņu primārajām kultūrām, un intraperitoneāli implantēti homologiem dzīvniekiem. Pētījumi parādīja, ka 45% kaulu smadzeņu monoklonālo celmu piemīt osteogēns potenciāls. Deviņās kamerās bija tikai retikulāri audi, bet vēl 13 kamerās tie bija sastopami kopā ar kaulu un skrimšļu audiem, kas veidoja 76% no visiem celmiem. O tipa kamerās, kur bija iespējama gan kaulu, gan skrimšļu audu diferenciācija, tika pētīti 16 celmi. Četrās kamerās (25%) veidojās gan kaulu, gan skrimšļu audi. Vēlreiz jāatzīmē, ka R. Čailakhjana u.c. (2001) pētījumos atsevišķas cilmes šūnas viena šūnu celma ietvaros piedzīvoja 31 līdz 34 dubultošanos, un to pēcnācēji sastāvēja no 0,9-2,0 x 109 ^šūnām. Poliklonālo celmu cilmes šūnu veikto mitožu skaits bija praktiski identisks monoklonālo celmu mitožu skaitam. Poliklonālo celmu attīstības ātrums, īpaši to veidošanās pirmajā fāzē, lielā mērā bija atkarīgs no koloniju skaita, kas izmantotas celmu iniciēšanai. Cilvēka embrija fibroblastu (WI-38) diploīdie celmi, atkārtoti klonējot 12.-15. dubultošanās līmenī, arī veidoja kolonijas, kas atšķīrās pēc diametra un šūnu satura. Lielas kolonijas, kas saturēja vairāk nekā 103 šūnas, veidoja tikai 5-10%. Palielinoties dalīšanās skaitam, lielo koloniju procentuālais daudzums samazinājās. Kaulu smadzeņu stromas fibroblastu monoklonālie un poliklonālie celmi saglabāja diploīdu hromosomu komplektu pēc 20 vai vairāk dubultošanās reizēm, un to attīstības tendence bija salīdzināma ar embrija fibroblastu diploīdu celmu attīstības dinamiku. Atsevišķu kaulu smadzeņu stromas cilmes šūnu diferenciācijas potenciāla analīze, kas veikta, transplantējot monoklonālos celmus difūzijas kamerās, parādīja, ka puse no tām bija osteogēnas. Lielas kolonijas veidoja 10% no to kopējā skaita. Līdz ar to osteogēno koloniju veidojošo šūnu skaits atbilda aptuveni 5% no to kopējās populācijas. Autoru identificēto osteogēno cilmes šūnu kopējā masa ietvēra šūnas, kas spēj vienlaikus veidot kaulu un skrimšļu audus. Turklāt pirmo reizi tika konstatēts, ka šiem diviem audu veidiem pieaugušā organismā ir kopīga cilmes šūna: 25% no testētajiem kloniem bija šādu šūnu radīti, un to skaits kopējā cilmes šūnu populācijā bija vismaz 2,5%.

Tādējādi atsevišķu kaulu smadzeņu fibroblastu klonu heterotopiska transplantācija ir atklājusi jaunus mezenhimālo cilmes šūnu populācijas strukturālās organizācijas aspektus. Ir atrastas stromas cilmes šūnas, kas spēj pārnest specifisku mikrovidi visiem hematopoētiskajiem asniem vienlaikus, kuru skaits starp dažādos modeļos pētītajiem lielajiem kloniem svārstās no 5 līdz 15% (0,5–1,5% no kopējā atklāto cilmes šūnu skaita). Līdztekus kloniem, kas pārnes pilnīgu kaulu smadzeņu mikrovidi, ir arī cilmes šūnas, kas noteiktas tikai osteoģenēzei, kuras, pārnesot atvērtā sistēmā, veido kaulu audus, kas neatbalsta hematopoēzes attīstību. To skaits no kopējā cilmes šūnu skaita ir 1,5–3%. Dažas no šīm šūnām spēj veidot kaulu audus ar ierobežotu pašapkalpošanās periodu. Līdz ar to stromas cilmes šūnu populācija ir neviendabīga savā diferenciācijas potenciālā. Starp tām ir šūnu kategorija, kas pretendē uz stromas cilmes šūnām, kas spēj diferencēties visos trijos kaulu smadzeņu stromas audiem raksturīgajos virzienos, veidojot kaulu, skrimšļus un retikulārus audus. Iesniegtie dati ļauj cerēt, ka, izmantojot dažādus šūnu marķierus, būs iespējams noteikt katra stromas šūnu veida ieguldījumu specifiskas mikrovides organizēšanā un hematopoēzes atbalstīšanā Dekstera kultūrās.

Mezenhimālo cilmes šūnu īpašības

Pēdējos gados ir konstatēts, ka stacionārās kaulu smadzeņu kultūrās multipotentas mezenhimālās cilmes šūnas ir pārstāvētas ar ierobežotu mazu agranulāru šūnu (RS-1 šūnu) populāciju, kam raksturīga zema koloniju veidošanas spēja un proliferējošām šūnām specifiskā Ki-67 antigēna ekspresijas neesamība. Miega stāvokļa RS-1 šūnu antigēniskie parametri atšķiras no strauji proliferējošu apņemtu stromas cilmes šūnu antigēnu spektra. Ir konstatēts, ka augsts apņemtu cilmes šūnu proliferācijas ātrums tiek novērots tikai RS-1 šūnu klātbūtnē. Savukārt RS-1 šūnas palielina savu augšanas ātrumu faktoru ietekmē, ko izdala visnobriedušākie multipotentu mezenhimālo cilmes šūnu atvasinājumi. Šķiet, ka RS-1 šūnas ir neapņemtu MSC apakšklase, kas spēj pārstrādāties. In vitro 5-fluoruracilam rezistentām kaulu smadzeņu stromas cilmes šūnām raksturīgs zems RNS saturs un augsta ornitīna dekarboksilāzes gēna, kas ir neproliferējošu šūnu marķieris, ekspresija.

Pēc stromas cilmes šūnu fiksācijas uz substrāta sākas intensīva proliferācija. Šajā gadījumā tiek ekspresēts vāji diferencētu šūnu marķieru profils: SH2 (TGF-(3) receptors), SH3 (signālproteīna domēns), I un III tipa kolagēns, fibronektīns, adhēzijas receptori VCAM-1 (CD106) un ICAM (CD54), kadherīns-11, CD44, CD71 (transferīna receptors), CD90, CD120a un CD124, bet bez hematopoētisko cilmes šūnu raksturīgo marķieru (CD34, CD14, CD45) ekspresijas. Klonālā augšana ļauj atkārtoti pasēt mezenhimālās cilmes šūnas, veidojot kultūrā daudzas ģenētiski homogēnas stromas cilmes šūnu pluripotentas šūnas. Pēc 2-3 pasāžām to skaits sasniedz 50-300 miljonus. Pietiekami blīvā kultūrā pēc proliferācijas apstāšanās stromas cilmes šūnas, atšķirībā no hematopoētisko audu fibroblastiem, diferencējas adipocītos, miocītos, skrimšļu un kaulu šūnās. Trīs regulējošo diferenciācijas signālu kombinācija, tostarp 1-metilizobutilksantīns (intracelulārā cAMP veidošanās induktors), deksametazons (fosfolipāžu A un C inhibitors) un indometacīns (ciklooksigenāzes inhibitors, kas arī samazina tromboksāna sintāzes aktivitāti), pārvērš līdz pat 95% mezenhimālo cilmes šūnu adipocītos. Adipocītu veidošanos no nenobriedušiem stromas elementiem apstiprina lipoproteīnu lipāzes gēna ekspresija, apolipoproteīnu un peroksisomu receptoru histoķīmiskā noteikšana. Viena klona šūnas TGF-b ietekmē bezseruma vidē rada homogēnu hondrocītu populāciju. Šī skrimšļa audu daudzslāņu šūnu kultūrai raksturīga attīstīta starpšūnu matrica, kas sastāv no proteoglikāna un II tipa kolagēna. Barības vielu vidē ar 10% diferenciācijas signāla kompleksa, kas sastāv no b-glicerofosfāta (neorganiska fosfāta donora), askorbīnskābes un deksametazona, ietekme vienā un tajā pašā stromas cilmes šūnu kultūrā noved pie šūnu agregātu veidošanās. Šādās šūnās novēro pakāpenisku sārmainās fosfatāzes aktivitātes un osteopontīna līmeņa paaugstināšanos, kas norāda uz kaulu audu veidošanos, kuru šūnu mineralizāciju apstiprina pakāpeniska intracelulārā kalcija satura palielināšanās.

Saskaņā ar dažiem datiem, mezenhimālo cilmes šūnu spēja neierobežoti dalīties un vairoties dažāda veida mezenhimālās diferenciācijas līnijas šūnām ir apvienota ar augstu plastiskuma pakāpi. Ievadot smadzeņu kambaros vai baltajā vielā, mezenhimālās cilmes šūnas migrē uz nervu audu parenhīmu un diferencējas par gliālo vai neironu šūnu līnijas atvasinājumiem. Turklāt ir informācija par MSC transdiferenciāciju hematopoētiskajās cilmes šūnās gan in vitro, gan in vivo. Padziļināta analīze dažos pētījumos ir noteikusi MSC ārkārtīgi augstu plastiskumu, kas izpaužas to spējā diferencēties astrocītos, oligodendrocītos, neironos, kardiomiocītos, gludo muskuļu šūnās un skeleta muskuļu šūnās. Vairāki pētījumi par MSC transdiferenciācijas potenciālu in vitro un in vivo ir pierādījuši, ka multipotentas kaulu smadzeņu izcelsmes mezenhimālās cilmes šūnas termināli diferencējas šūnu līnijās, kas veido kaulu, skrimšļu, muskuļu, nervu un taukaudus, kā arī cīpslas un stromu, kas atbalsta hematopoēzi.

Tomēr citos pētījumos neizdevās atklāt nekādas mezenhimālo cilmes šūnu genoma un stromas šūnu cilmes šūnu populāciju pluripotences ierobežojuma pazīmes, lai gan tika pētīti vairāk nekā 200 no vienas primārās kultūras izolētu MSC klonu, lai pārbaudītu iespējamo stromas šūnu pluripotenci. Lielākā daļa klonu in vitro saglabāja spēju diferencēties osteogēnā, hondrogēnā un adipogēnā virzienā. Izslēdzot recipienta šūnu migrācijas varbūtību, transplantējot mezenhimālās cilmes šūnas zem nieru kapsulas vai difūzijas kamerās, izrādījās, ka stromas cilmes šūnas in situ saglabā heterogēnu fenotipu, kas norāda vai nu uz restrikcijas faktoru neesamību transplantācijas zonā, vai uz MSC pluripotences neesamību kā tādu. Tajā pašā laikā tiek pieļauta reta somatisko pluripotento cilmes šūnu veida esamība, kas ir visu pieaugušo cilmes šūnu kopīgi priekšteči.

Patieso mezenhimālo cilmes šūnu, kas veido ļoti nelielu daļu no kaulu smadzeņu šūnām un noteiktos apstākļos in vitro kultivēšanas laikā spēj vairoties bez diferenciācijas, multipotence, bet ne pluripotence, ir pierādīta ar to inducēto saistīšanos ar kaulu, skrimšļu, taukaudu, muskuļu audu šūnām, kā arī tenocītiem un stromas elementiem, kas atbalsta hematopoēzi. Parasti ilgstoša iedarbība ar barotni ar teļa augļa serumu izraisa MSC izdalīšanos specializētās stromas cilmes šūnās, kuru pēcnācēji piedzīvo spontānu terminālu diferenciāciju. In vitro ir iespējams panākt mērķtiecīgu osteoblastu veidošanos, pievienojot kondicionēšanas barotnei deksametazonu, ß-glicerofosfātu un askorbīnskābi, savukārt deksametazona un insulīna diferenciācijas signālu kombinācija inducē adipocītu veidošanos.

Ir noskaidrots, ka pirms nonākšanas terminālās diferenciācijas stadijā kaulu smadzeņu MSC sākotnēji diferencējas par fibroblastiem līdzīgām mezenhimālām cilmes šūnām noteiktos kultivēšanas apstākļos. Šo šūnu atvasinājumi in vivo piedalās kaulu, skrimšļu, cīpslu, taukaudu un muskuļu audu, kā arī stromas, kas atbalsta hematopoēzi, veidošanā. Daudzi autori ar terminu "multipotentas mezenhimālās cilmes šūnas" saprot gan pašas MSC, gan specializētas kaulu smadzeņu un mezenhimālo audu stromas cilmes šūnas. Kaulu smadzeņu izcelsmes multipotentu mezenhimālo cilmes šūnu klonālā analīze parādīja, ka nedaudz vairāk kā trešdaļa visu klonu diferencējas osteo-, hondro- un adipocītos, savukārt atlikušo klonu šūnām ir tikai osteogēns potenciāls un tās veido tikai hondro- un osteocītus. Multipotentu mezenhimālo cilmes šūnu klons, piemēram, BMC-9, atbilstošos mikrovides apstākļos diferencējas par šūnām ar ne tikai osteoblastu, hondrocītu un adipocītu, bet arī stromas šūnu, kas atbalsta hematopoēzi, fenotipu un funkcionālajām īpašībām. No žurkas augļa kaulu smadzenēm izolēts RCJ3.1 šūnu klons diferencējas dažādu fenotipu mezenhimālās šūnās. Askorbīnskābes, b-glicerofosfāta un deksametazona kombinētās darbības rezultātā šī klona šūnu elementi vispirms veido daudzkodolu miocītus un pēc tam secīgi adipocītus, hondrocītus un mineralizētu kaulu audu saliņas. Žurku augļu periosta granulēto šūnu populācija atbilst nesaistītām daudzpotentām mezenhimālām cilmes šūnām, jo tai raksturīgs zems proliferācijas ātrums, tā neizpauž diferenciācijas marķierus un kultūras apstākļos diferencējas, veidojot hondro-, osteo- un adipocītus, kā arī gludās muskulatūras šūnas.

Tādējādi jāatzīst, ka jautājums par mezenhimālo cilmes šūnu genoma pluri- vai multipotenci paliek atklāts, kas attiecīgi ietekmē arī priekšstatus par stromas cilmes šūnu diferenciācijas potenciālu, kas arī nav galīgi noteikts.

Eksperimentāli pierādīta un svarīga mezenhimālo cilmes šūnu īpašība ir to spēja atstāt audu nišu un cirkulēt vispārējā asinsritē. Lai aktivizētu ģenētiskās diferenciācijas programmu, šādām cirkulējošām cilmes šūnām jānonāk atbilstošā mikrovidē. Ir pierādīts, ka, sistemātiski ievadot MSC recipientu dzīvnieku asinsritē, nenobriedušas šūnas tiek implantētas dažādos orgānos un audos, pēc tam diferencējoties asins šūnās, miocītos, adipocītos, hondrocītos un fibroblastos. Līdz ar to lokālajās audu zonās notiek signālregulējoša mijiedarbība starp nesaistītām un saistītām stromas cilmes šūnām, kā arī starp tām un apkārtējām nobriedušām šūnām. Tiek pieņemts, ka diferenciāciju inducē mezenhimālas un nemenhimālas izcelsmes parakrīnie regulatori (augšanas faktori, eikozanoīdi, ekstracelulārās matricas molekulas), kas nodrošina telpiskus un laika savienojumus multipotentu mezenhimālo cilmes šūnu mikrovidē. Tāpēc lokāliem mezenhimālo audu bojājumiem vajadzētu izraisīt tādu multipotentu mezenhimālo cilmes šūnu mikrovides zonu veidošanos, kas kvalitatīvi atšķiras no neskartu audu regulējošo signālu kompleksa, kurās notiek fizioloģiski, nevis reparatīvi reģenerācijas procesi. Šī atšķirība ir ārkārtīgi svarīga šūnu fenotipa specializācijas ziņā normālā un bojājumu izraisītā mikrovidē.

Saskaņā ar koncepcijām, tieši šeit ir iestrādāti divu zināmo procesu - fizioloģiskās reģenerācijas un iekaisuma proliferācijas - fundamentālās atšķirības mehānismi. Pirmais no tiem beidzas ar audu specializētā šūnu sastāva un tā funkcijas atjaunošanu, savukārt proliferācijas procesa īstenošanas rezultāts ir nobriedušu saistaudu elementu veidošanās un bojātās audu zonas funkcijas zudums. Tādējādi, lai izstrādātu optimālas programmas multipotentu mezenhimālo cilmes šūnu izmantošanai reģeneratīvi plastiskajā medicīnā, ir nepieciešams rūpīgs mikrovides faktoru ietekmes uz MSC diferenciāciju izpētes process.

Nav apšaubāma cilmes šūnu nodalījuma struktūras atkarība no šūnu para- un autokrīnajiem regulatoriem, kuru ekspresiju modulē ārējie signāli. Starp regulējošo faktoru funkcijām vissvarīgākās ir MSC asimetriskās dalīšanās kontrole un gēnu ekspresija, kas nosaka saistību stadijas un šūnu dalīšanās reižu skaitu. Ārējos signālus, no kuriem atkarīga MSC tālākā attīstība, nodrošina to mikrovide. Nenobriedušā stāvoklī MSC ilgstoši proliferējas, saglabājot spēju diferencēties adipocītu, miofibroblastu, hematogēno audu stromas, skrimšļu un kaulu šūnu līnijās. Ir konstatēts, ka ierobežota CD34 negatīvu stromas šūnu elementu populācija, kas cirkulē asinīs, no vispārējās asinsrites atgriežas kaulu smadzeņu stromā, kur tā tiek pārveidota par CD34 pozitīvu hematopoētisko cilmes šūnu līnijām. Šie novērojumi liecina, ka mezenhimālo cilmes šūnu cilmes šūnu recirkulācija asinsritē uztur stromas cilmes šūnu audu līdzsvaru dažādos orgānos, mobilizējot kopīgu kaulu smadzeņu nenobriedušu stromas elementu kopumu. MSC diferenciācija šūnās ar vairākiem mezenhimāliem fenotipiem un to dalība kaulu, skrimšļu, taukaudu un cīpslu reģenerācijā vai atjaunošanā in vivo ir pierādīta, izmantojot adoptīvās pārneses modeļus eksperimentāliem dzīvniekiem. Saskaņā ar citu autoru datiem, MSC attāla migrācija pa asinsvadu gultni ir apvienota ar multipotentu mezenhimālo cilmes šūnu īslaicīgu vai lokālu pārvietošanos audos skrimšļa atjaunošanas, muskuļu reģenerācijas un citu atjaunojošo procesu laikā.

Stromas audu bāzes lokālās cilmes rezerves darbojas kā šūnu avots fizioloģiskās audu reģenerācijas procesos un tiek papildinātas ar MSC attālu transportu, patērējot stromas audu cilmes resursus. Tomēr apstākļos, kad nepieciešama ārkārtas reparatīvā šūnu potenciāla mobilizācija, piemēram, politraumas gadījumā, viss MSC ešelons piedalās reparatīvās reģenerācijas procesos, un kaulu smadzeņu mezenhimālās cilmes šūnas tiek piesaistītas perifērijai caur vispārējo asins plūsmu.

Mezenhīmas cilmes šūnu transplantācija

Var izsekot zināmas paralēles starp fizioloģiskās audu reģenerācijas procesiem un to veidošanos intrauterīnās attīstības laikā. Cilvēka un zīdītāju embrioģenēzē dažādu veidu specializētu šūnu veidošanās notiek no dīgļslāņu ekto-, mezo- un endodermālā kopuma, bet ar obligātu mezenhīma līdzdalību. Embrionālo mezenhīma audu vaļīgais šūnu tīkls veic daudzas regulējošas, vielmaiņas, karkasa un morfoģenētiskas funkcijas. Pagaidu orgānu klāšana notiek tikai pēc mezenhīma kondensācijas, pateicoties cilmes šūnu klonogēnai augšanai, kas ģenerē primāros organoģenēzes morfoģenētiskos signālus. Embrionālā mezenhīma stromas atvasinājumi veido pagaidu orgānu šūnu karkasu un veido pamatu to turpmākajai enerģētiski plastiskajai apgādei, pateicoties primāro asins un limfvadu augšanai. Citiem vārdiem sakot, augļa orgānu mikrocirkulācijas vienības stromas elementi rodas pirms to strukturālo un funkcionālo vienību veidošanās. Turklāt mezenhimālo šūnu aktīvā migrācija organoģenēzes laikā nodrošina attīstošo orgānu telpisko orientāciju, iezīmējot to tilpuma robežas, ierobežojot homeotiskos Hox tipus. Stromas karkass kalpo arī par pamatu parenhimatozo orgānu strukturālo un funkcionālo vienību montāžai, kas bieži vien ietver morfoģenētiski un funkcionāli pilnīgi atšķirīgas šūnas. Līdz ar to embriogenēzes laikā mezenhīma funkcijas ir primāras un tiek realizētas, ģenerējot regulējošos signālus, kas aktivizē epitēlija cilmes šūnu reģionālo proliferāciju un diferenciāciju. Embrionālās mezenhīma šūnas ražo augšanas faktorus, piemēram, HGF-b, HGF-b, CSF, kuriem parenhimālajām cilmes šūnām ir atbilstoši receptori. Pieauguša organisma diferencētos nobriedušos audos stromas šūnu tīkls ģenerē arī signālus, lai uzturētu nemezenhimālas izcelsmes cilmes šūnu dzīvotspēju un proliferāciju. Tomēr stromas regulējošo signālu spektrs postnatālajā ontoģenēzē ir atšķirīgs (SCF, HGF, IL-6, IL-1, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, GM-CSF, flt-3, LIF utt.) un ir vērsts uz bojāto audu zonu fizioloģiskas reģenerācijas vai atjaunošanas nodrošināšanu. Turklāt stromas regulējošo faktoru spektrālās īpašības katrā audu tipā un pat viena orgāna ietvaros ir atšķirīgas. Jo īpaši hematopoēze un limfopoēze ar hematopoētisko un imūnkompetento šūnu proliferāciju un diferenciāciju notiek tikai noteiktos orgānos, kuru robežās darbojas stromas mikrovide, nodrošinot apstākļus hematopoētisko un limfoīdo šūnu nobriešanai. Hematopoētisko un limfoīdo šūnu spēja atjaunot noteiktu orgānu, vairoties un nobriest tā mikrostrukturālajās nišās ir atkarīga no mikrovides regulējošajiem faktoriem.

Starp ekstracelulārās matrices komponentiem, ko producē multipotentās mezenhimālās cilmes šūnas, jāatzīmē fibronektīns, laminīns, kolagēns un proteoglikāni, kā arī CD44 (hialuronāna un osteopontīna receptors), kuriem ir liela nozīme starpšūnu mijiedarbības organizēšanā un ekstracelulārās matrices veidošanā kaulu smadzenēs un kaulu audos. Ir pierādīts, ka kaulu smadzeņu multipotentās mezenhimālās cilmes šūnas rada stromas mikrovidi, kas nodrošina induktīvus un regulējošus signālus ne tikai MSC, bet arī hematopoētiskajiem cilmes šūnām un citām kaulu smadzeņu nemezhenīmiskajām cilmes šūnām. Ir zināms, ka MSC dalību hematopoēzē nosaka to spēja diferencēties par stromas šūnām, kas atbalsta hematopoēzi, un šo instruktīvo signālu MSC saņem tieši no hematopoētiskajām cilmes šūnām. Tāpēc kultūrā stromas cilmes šūnu tīkls kalpo kā barotnes bāze visu hematopoētisko šūnu klonu attīstībai.

Nobriedušā organismā hemo- un limfopoēzes intensitāte ir dinamiskā līdzsvara stāvoklī ar nobriedušu asins šūnu un imūnsistēmas šūnu "izlietojumu" perifērijā. Tā kā kaulu smadzeņu un limfoīdo orgānu stromas šūnas atjaunojas ārkārtīgi reti, būtiska stromas struktūru pārstrukturēšana tajās nenotiek. Sistēmu var izvest no dinamiskā līdzsvara, mehāniski bojājot jebkuru no hemo- vai limfopoēzes orgāniem, kas noved pie vienmērīgām secīgām izmaiņām, kas skar ne tikai un ne tik daudz hematopoētiskos vai limfoīdos elementus, cik bojātā orgāna stromas struktūras. Reparatīvās reģenerācijas procesā vispirms veidojas stromas bāze, kuru pēc tam aizpilda hematopoētiskās vai imūnkompetentās šūnas. Šis sen zināmais fakts padara posttraumatisko reģenerāciju par ērtu modeli hematopoētisko orgānu stromas mikrovides pētīšanai. Jo īpaši cauruļveida kaulu smadzeņu dobuma mehāniska iztukšošana tiek izmantota, lai pētītu kaulu smadzeņu reparatīvo reģenerāciju - kiretāžu, kas ļauj ātri un efektīvi izņemt hematopoētiskos audus no dinamiskā līdzsvara stāvokļa. Pētot kaulu smadzeņu hematopoētisko un stromas komponentu reparatīvās reģenerācijas procesus pēc jūrascūciņu stilba kaula serdes dobuma mehāniskas iztukšošanas, tika konstatēts, ka nav tiešas korelācijas starp hematopoētisko un stromas šūnu reģenerācijas rādītājiem (hematopoētisko šūnu skaitu, stromas cilmes šūnu koncentrāciju un skaitu). Turklāt izrādījās, ka stromas cilmes šūnu populācijas pieaugums notiek agrāk pēc kiretāžas, un paši stromas fibroblasti kļūst fosfatāzes pozitīvi, kas ir raksturīgi osteogēniem audiem. Ir arī konstatēts, ka 3-5 cauruļkaulu kiretāža noved pie šo šūnu populācijas pieauguma neoperētu kaulu kaulu smadzenēs un pat liesā, kas jūrascūciņām ir tikai limfopoētisks orgāns.

Jūrascūciņu kuretētu stilba kaulu reparatīvo procesu morfoloģiskā aina kopumā atbilst literatūrā aprakstītajiem datiem, kas iegūti eksperimentos ar citu sugu dzīvniekiem, un izmaiņu dinamika pēc hematopoētisko audu izņemšanas visām dzīvnieku sugām ir vienāda, un atšķirība attiecas tikai uz laika parametriem. Morfoloģiski hematopoēzes atjaunošanās fāžu secība iztukšotajā smadzeņu dobumā sastāv no secīgiem asins recekļa organizācijas, rupjo šķiedru kaulaudu veidošanās, to rezorbcijas, sinusoīdu attīstības un retikulāras stromas veidošanās procesiem, ko pēc tam atkal apdzīvo hematopoētiskie elementi. Šajā gadījumā hematopoētisko cilmes šūnu skaits kaulu smadzeņu audu reģenerācijas procesā palielinās līdz ar hematopoētisko cilmes šūnu satura palielināšanos.

Ju. Gerasimovs un līdzautori (2001) salīdzināja hematopoētisko šūnu skaita un stromas cilmes šūnu skaita izmaiņas atsevišķās reģenerācijas procesa fāzēs. Izrādījās, ka kvantitatīvās izmaiņas kaulu smadzeņu šūnās kiretētos kaulos atbilst reģenerācijas morfoloģisko īpašību dinamikai. Autori saista šūnu satura samazināšanos reģenerātos pirmo trīs dienu laikā ar hematopoētisko šūnu bojāeju nelabvēlīgās mikrovides ietekmes dēļ, ko rada proliferējošie retikulārie audi saglabātajās kaulu smadzenēs epifīzes rajonā, kā arī ar osteoīdu audu perēkļu veidošanos pēdējos un asinsvadu bojājumiem kiretāžas laikā. 7.-12. dienā kodoloto šūnu līmeņa paaugstināšanās sakrīt ar atsevišķu mieloīdās hematopoēzes perēkļu parādīšanos stromas elementu proliferācijas zonās. 20. dienā parādās ievērojamas reģenerētu kaulu smadzeņu un labi attīstītu deguna blakusdobumu zonas, ko pavada ievērojams kopējā šūnu skaita pieaugums. Tomēr hematopoētisko elementu skaits šajā periodā ir 68% no kontroles līmeņa. Tas saskan ar iepriekš publicētajiem datiem, ka hematopoētisko šūnu skaits pēc kiretāžas sasniedz normu tikai 35.–40. dienā pēc operācijas.

Agrīnā pēctraumatiskā periodā galvenais hematopoēzes atjaunošanas avots ir lokālie šūnu elementi, kas saglabāti kiretāžas laikā. Vēlākos posmos galvenais kaulu smadzeņu hematopoētisko audu reģenerācijas avots ir cilmes šūnas, kas atjauno brīvās stromas zonas. Attiecībā uz atsevišķām stromas šūnu kategorijām (endotēlija, retikulārās un osteogēnās) avoti, kas nodrošina to veidošanos kaulu smadzeņu dobuma reorganizācijas laikā, joprojām nav skaidri. Ju. V. Gerasimova un līdzautoru (2001) pētījuma rezultāti liecina, ka pēc kiretāžas saglabātajās kaulu smadzenēs fibroblastu kolonijas veidojošo šūnu koncentrācija ir ievērojami augstāka nekā normālās kaulu smadzenēs. Autori uzskata, ka kiretāža izraisa intensīvāku selektīvu hematopoētisko šūnu izskalošanos salīdzinājumā ar koloniju veidojošajām stromas šūnām, kas piedalās stromas veidošanā un ir spēcīgāk saistītas ar tās galveno vielu nekā hematopoētiskās šūnas.

Fibroblastu kolonijas veidojošo šūnu skaita izmaiņu dinamika korelē ar osteoģenēzes procesu intensitāti, sekojošu kaulu trabekulu rezorbciju un retikulāras stromas veidošanos, ko apdzīvo hematopoētiskās šūnas. Lielākā daļa stromas cilmes šūnu noteiktajos reģenerācijas termiņos veido rupjus šķiedru kaulaudus un retikulāru stromu. Augšstilba kaula lūzumu gadījumā ilgstošas osteosintēzes apstākļos 5. dienā reģenerācijas zonā palielinās fibroblastu kolonijas veidojošo šūnu koncentrācija un skaits, un intensīvas kaulu veidošanās periodā to skaits palielinās 6 reizes. Ir zināms, ka fibroblastu kolonijas veidojošajām kaulu smadzeņu šūnām piemīt osteogēnas īpašības. Stromas cilmes šūnu skaits palielinās pirms hematopoētisko šūnu apmetšanās kuretētajā kaulu smadzeņu teritorijā. Tas labi saskan ar datiem, ka stromas šūnas nodrošina hematopoētiskās mikrovides veidošanos. Acīmredzot hematopoētiskās mikrovides izveidošanās atbilst noteiktam stromas audu reģenerācijas līmenim, un hematopoētisko šūnu skaits palielinās, paplašinoties hematopoēzei piemērotajai stromas platformai.

Vislielāko interesi rada autoru dati, ka tūlīt pēc kiretāžas palielinās stromas cilmes šūnu skaits skeleta attālākajās daļās. Sākot no sestās stundas un līdz divdesmitajai dienai ieskaitot, kontralaterālajā stilba kaulā novēro vairāk nekā divkāršu gan koncentrācijas, gan fibroblastu kolonijas veidojošo šūnu skaita pieaugumu. Šīs parādības mehānisms, iespējams, ir saistīts ar to, ka masīvs kaulu smadzeņu bojājums izraisa liela skaita asins recekļu veidošanos, vienlaikus iznīcinot ievērojamu skaitu trombocītu un izdalot asinīs trombocītu augšanas faktoru (PDGF), kas, kā zināms, izraisa fibroblastu kolonijas veidojošo šūnu proliferāciju organismā ārpus proliferatīvā baseina. Eksperimentos ar trušiem lokāla MSC ievadīšana veicina ķirurģiski bojātās ceļa locītavas skrimšļa audu atjaunošanos, kas var būt saistīts ar hondrocītu veidošanos no injicētajām MSC. Tomēr laboratorijas žurkām kaulu defektu reparatīvā reģenerācija tiek ievērojami uzlabota, izmantojot keramikas karkasā ievietotas mezenhimālās cilmes šūnas. Tādēļ var pieņemt, ka, ja ne RBOC, tad kāds cits faktors, kura izcelsme ir bojātas stromas šūnas, iedarbojas attāli stimulējoši uz mezenhimālo cilmes šūnu proliferāciju neskartās kaulu smadzeņu zonās un stimulē to migrāciju uz kaulu smadzeņu defekta zonu. Savukārt tam pretrunā iepriekšējo gadu literatūras dati, kas norāda, ka par mikrovidi atbildīgās stromas šūnas, atšķirībā no hematopoētiskajām šūnām, nespēj migrēt un to izcelsme ir lokāli.

Tomēr Ju. Gerasimova un līdzautoru (2001) pētījuma rezultāti liecina, ka mehāniska trauma izraisa ne tikai strauju stromas audu pārstrukturēšanu kuretētā kaulā, bet arī būtiskas izmaiņas stromā attālos neskartos kaulos, t.i., notiek stromas audu sistēmiska reakcija uz lokālu traumu. Turklāt, ja tiek nodarīta politrauma - daudzkārtēja kuretāža -, šī reakcija pastiprinās un tiek novērota ne tikai operētajā kaulā un skeleta attālās daļās, bet arī limfoīdos orgānos, jo īpaši liesā. Šādas kaulu smadzeņu un liesas stromas audu sistēmiskas reakcijas mehānisms uz lokālu traumu un politraumu joprojām nav zināms. Tiek pieņemts, ka šis process ir saistīts ar humorālā faktora darbību, ko izdala kaulu smadzeņu serdes dobuma mezenhimālā stroma. Dati par to koloniju stimulējošo aktivitāti kaulu smadzeņu monoslāņa kultūrās liecina par iespēju, ka kaulu smadzeņu un liesas stromas šūnas producēs orgāniem nespecifisku humorālo faktoru, kas ir atbildīgs par fibroblastu kolonijas veidojošo šūnu proliferāciju.

Šajā sakarā ir vērts atzīmēt, ka, sistēmiski ievadot multipotentas mezenhimālās cilmes šūnas, to atvasinājumi atjauno ne tikai kaulu smadzenes, bet arī citus audus, ko jo īpaši izmanto gēnu terapijā. Ir pierādīts, ka, intravenozi ievadot lielu daudzumu MSC ar savvaļas tipa genomu pelēm ar mutāciju kolagēna I gēnā, donoru šūnas aizstāj līdz pat 30% šūnu recipientu kaulu un skrimšļu audos, un transfektētās peles mezenhimālās cilmes šūnas, kas izdala cilvēka IL-3, efektīvi atbalsta hematopoēzi 9 mēnešus, ja tās tiek ievadītas vienlaicīgi ar cilvēka hematopoētiskajām cilmes šūnām pelēm ar imūndeficītu.

[ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Mezenhimālo cilmes šūnu ģenētiskā modifikācija

Starp MSC eksperimentālās ģenētiskās modifikācijas panākumiem jāatzīmē IX faktora gēna transfekcija cilvēka MSC ar sekojošu transfektantu šūnu pārnešanu uz imūndeficīta pelēm, kas noved pie antihemofīlā B faktora parādīšanās asinīs 8 nedēļas pēc transplantācijas. Šajā eksperimentā transfektētajās šūnās tika veikta IX faktora posttranslācijas modifikācija ar γ-glutamilkarboksilāzi. MSC transdukcija ar retrovīrusu vektoru, kas kodē cilvēka IX faktoru, bija mazāk veiksmīga - šo šūnu sekojoša ievadīšana sunim ar B hemofiliju nodrošināja terapeitisku IX faktora līmeni, saglabājot normālu koagulācijas hemostāzes intensitāti, tikai 12 dienas.

Mezenhimālo cilmes šūnu transplantācija dzīvnieku smadzeņu parenhīmā ir parādījusi, ka donoru nenobriedušās šūnas tiek transformētas gan neironu, gan gliju populācijās. Veselīgu donoru mezenhimālo audu neironu atvasinājumu transplantācija teorētiski ļauj koriģēt smadzeņu metabolisma ģenētiskās anomālijas pacientiem ar Gošē slimību un citiem lipīdu, gangliozīdu vai ogļhidrātu metabolisma traucējumiem.

Eksperimentāli tiek meklēti apstākļi kaulu smadzeņu stromas cilmes šūnu transdiferenciācijai neironu un aknu audu cilmes šūnās. Pētnieku uzmanība ir pievērsta diferenciācijas induktoru un īpašu kondicionētu barotņu kombinācijām. Jo īpaši, lai izolētu stromas šūnu primāro kultūru, kaulu smadzeņu šūnas, kas mazgātas un atkārtoti suspendētas DMEM/F12 (1/1) barotnē ar 10% fetāla teļa seruma, tiek iesētas ar blīvumu 200 000/cm2. Pēc 24 stundām nepielipušās šūnas tiek noņemtas, un pie plastmasas pielipušās fibroblastiem līdzīgās šūnas tiek kultivētas vienu nedēļu. Kaulu smadzeņu stromas šūnu diferenciācijai neiroblastos tiek izmantota kondicionēta barotne, kas iegūta, trīs dienas kultivējot peļu embriju fibroblastu primāro kultūru, kā arī DMEM/F12 barotne (1/1) ar 2% fetāla teļa serumu un pievienojot 20 ng/ml NF vai 10-6 M retīnskābes (neiroinducētājus, ko izmanto peļu un cilvēka embriju cilmes šūnu neironu diferenciācijai). Kaulu smadzeņu stromas šūnu diferenciācija hepatocītu prekursoršūnās tiek inducēta kondicionētā vidē, kas izveidota, trīs dienas kultivējot peļu embrionālo aknu šūnu primāro kultūru DMEM/F12 vidē (1/1), pievienojot 10% teļa fetāla seruma.

Šeit vēlreiz jāatzīmē, ka kaulu smadzeņu stromas koloniju veidojošās šūnas ir heteromorfas un tās var iedalīt divos veidos. Pirmajā tipā ietilpst fibroblastiem līdzīgas šūnas, kas veido filopodijas ar lieliem kodoliem un vienu vai diviem kodoliņiem. Otro tipu pārstāv mazas vārpstveida šūnas. Kultivējot abu tipu šūnas kondicionētā vidē, kas iegūta uz primāro peļu embriju fibroblastu barotnes slāņa, 3.–4. dienā kultūrā parādās neiroblastiem līdzīgas šūnas. Šajā posmā tām visbiežāk ir vārpstveida forma ar vienu vai diviem gariem izaugumiem, kas beidzas ar filopodijām. Retāk sastopamas piramīdveida vai stellātu šūnas ar īsiem dendritiem. Dažu neiroblastu dendritiem distālajā daļā ir raksturīgi izaugumi (augšanas pumpuri) un zari, savukārt citiem ir izteikti augšanas konusi ar filopodijām, caur kuriem aug dendrīti. Līdzīgas morfoloģiskas pazīmes (pumpuri un augšanas konusi ar filopodijām), kas raksturīgas neiroblastiem, kas diferencējas par neironiem, ir detalizēti aprakstītas neiroģenēzes pētījumos. Pamatojoties uz to, daži autori secina, ka kultūrā atrastās šūnas ir neiroblasti. Jo īpaši E. Ščegelskaja un līdzautori (2002) pēc divu nedēļu ilgas stromas šūnu primārās kultūras kultivēšanas kondicionētā vidē, kas tika mainīta ik pēc 3. līdz 4. dienai, atklāja, ka dažas no šūnām proliferējās, saglabājot nediferencētu stāvokli. Ārēji šādas šūnas atgādināja fibroblastus un kultūrā tika konstatētas kopā ar diferencējošiem neiroblastiem. Lielākā daļa šūnu (apmēram 80%) atradās dažādās nervu audu šūnu diferenciācijas stadijās, galvenokārt neironos. Šo šūnu dendrītiskie izaugumi bija ciešā kontaktā viens ar otru, tāpēc šūnas pakāpeniski veidoja nervu tīkla sekcijas uz substrāta garu daudzšūnu šķiedru veidā. Neiroblastu dendrītiskie izaugumi kļuva ievērojami garāki, daži no tiem 8-10 reizes pārsniedza paša neirona ķermeņa garumu. Pakāpeniski palielinājās piramīdveida un stellātu šūnu īpatsvars. Zvaigžņu šūnu dendrīti sazarojās. Pēc autoru domām, piramīdveida un stellātu šūnu vēlāka diferenciācija salīdzinājumā ar vārpstveida šūnām atbilst normālas neiroģenēzes stadiju secībai dzīvniekiem. Rezultātā autori secina, ka kaulu smadzeņu stromas cilmes šūnas piedzīvo inducētu neiroģenēzi, kuras laikā no neiroblastiem in vitro veidojas visi trīs galvenie neironu veidi. Nervu šūnu prekursori tika atklāti arī kaulu smadzeņu stromas šūnu kultivēšanas laikā 3-4 dienas vidē ar 2% augļa serumu un 20 ng/ml LIF. Taču šajā gadījumā cilmes šūnas dalījās ļoti lēni, neiroblastu diferenciācija notika tikai 30% gadījumu, un tās neveidoja neironu tīklus. Izmantojot retīnskābi kā vienu no nervu šūnu diferenciācijas induktoriem, autori kultūrā ieguva līdz pat 25-30% nervu šūnu,ar gliālajiem elementiem pārsvarā - astrocītiem un oligodendrocītiem. Neironi veidoja tikai trešdaļu no visām nervu šūnām, lai gan tie bija pārstāvēti visos trīs veidos: vārpstveida, piramīdveida un stellātu šūnas. Stromas šūnu kultivēšanas 6. dienā vidē ar retīnskābi nervu šūnas kļuva diferencētākas, un atsevišķos piramīdveida neironos tika atrasti aksoni, kas normālā neiroontoģenēzē parādās vēlāk nekā dendrītisko izaugumu veidošanās. Pēc autoru domām, neskatoties uz zemo nervu šūnu ražu, retīnskābes indukcijas metodei ir savas priekšrocības: oligodendrocīti un astrocīti dendrītu un aksonu augšanas laikā veic mielinizācijas un barošanās funkcijas un ir nepieciešami normālai nervu audu veidošanai. Tāpēc bojāto zonu atjaunošanai in vivo labāk ir izmantot neironu suspensiju, kas bagātināta ar gliālajām šūnām.

Otrajā eksperimentu sērijā autori mēģināja izraisīt kaulu smadzeņu stromas šūnu diferenciāciju aknu šūnās. Pēc trīs dienu ilgas kaulu smadzeņu stromas cilmes šūnu kultivēšanas kondicionētā vidē, kas iegūta, inkubējot peļu embrionālos hepatocītus, tika atrastas lielas, sfēriskas šūnas, bieži vien divkodolu, ar dažāda lieluma citoplazmas ieslēgumiem. Šīs šūnas atradās dažādās diferenciācijas stadijās un atšķīrās pēc izmēra, kodolu skaita un ieslēgumiem citoplazmā. Lielākajā daļā šo šūnu tika atklāts glikogēns, uz kura pamata autori tās identificēja kā hepatocītu prekursoršūnas. Tā kā kultūrā netika atrastas neiroblastiem līdzīgas šūnas, tika secināts, ka kondicionētajā vidē, kas iegūta, kultivējot embrionālos hepatocītus, trūkst nervu šūnu diferenciācijas faktoru un, gluži pretēji, ir faktori, kas inducē kaulu smadzeņu stromas šūnu diferenciāciju hepatocītu prekursoršūnās. Noslēgumā autori norāda uz pluripotences klātbūtni kaulu smadzeņu stromas šūnās, jo tās in vitro diferencējas nervu vai aknu audu šūnās atkarībā no izmantotās specifiskās kondicionētās vides un induktoriem.

Daži pētījumi patiešām ir pareizi parādījuši kaulu smadzeņu stromas šūnu diferenciāciju kardiomiocītos, skrimšļos, kaulu un nervu audu šūnās. Ir pierādījumi, ka starp kaulu smadzeņu šūnām ir cilmes šūnu populācijas, kas spēj diferencēties hepatocītos. Ņemot vērā šos datus, iepriekš minēto eksperimentu rezultātus ar pelēm joprojām var uzskatīt par vēl vienu apstiprinājumu pluripotentu mezenhimālo cilmes šūnu klātbūtnei kaulu smadzenēs, kas spēj diferencēties pieauguša organisma dažādu audu šūnās.

Mezenhīmas cilmes šūnu transplantācija

Klīniskajā transplantoloģijā cilvēka mezenhimālās cilmes šūnas var izmantot, lai nodrošinātu hematopoētisko cilmes šūnu, kā arī to agrīno preapproved pēcnācēju paplašināšanos. Jo īpaši autologu hematopoētisko cilmes šūnu un MSC ievadīšana vēža pacientiem pēc lielas devas ķīmijterapijas paātrina neitrofilu un trombocītu skaita atjaunošanos perifērajās asinīs. Alo- un autologas mezenhimālo cilmes šūnu transplantācijas tiek izmantotas multiplas mielomas, aplastiskās anēmijas un spontānas trombocitopēnijas - slimību, kas saistītas ar primāru defektu hematopoētisko audu stromā, ārstēšanai. Šūnu terapijas efektivitāte onkohematoloģiskajā patoloģijā daudzos gadījumos ir augstāka, vienlaikus ieviešot stromas un hematopoētiskās cilmes šūnas, kas izpaužas kā hematopoēzes atjaunošanas pēcoperācijas perioda samazināšanās, letālu iznākumu skaita samazināšanās reģionālo un cirkulējošo vēža šūnu neselektīvas iznīcināšanas dēļ, kurā iet bojā arī pacienta paša hematopoētiskās cilmes šūnas. MSC un citu multipotentu mezenhimālo cilmes šūnu izmantošanas perspektīvas klīniskajā praksē ir saistītas ar relatīvi vieglu to iegūšanu no kaulu smadzeņu aspirātiem, paplašināšanu kultūrā un terapeitisko gēnu transfekciju. Vienlaikus lokālu daudzpotentu mezenhimālo cilmes šūnu implantāciju var izmantot, lai kompensētu lokālus audu defektus, un mezenhimālas izcelsmes audu sistēmisku disfunkciju gadījumā nav izslēgta to ievadīšana vispārējā asinsritē.

Darbu autori, kuros no stromas šūnu bioloģijas viedokļa tiek analizētas MSC izmantošanas perspektīvas lokālai, sistēmiskai transplantācijai un gēnu terapijai, savos argumentos ir piesardzīgāki. Pēcdzemdību kaulu smadzenes tradicionāli tiek uzskatītas par orgānu, kas sastāv no divām galvenajām skaidri definētu šūnu līniju sistēmām - pašiem hematopoētiskajiem audiem un ar tiem saistītās atbalsta stromas. Tāpēc kaulu smadzeņu mezenhimālās cilmes šūnas sākotnēji tika uzskatītas tikai par stromas bāzes avotu hematopoētiskās mikrovides regulējošo faktoru ražošanai. Pēc tam pētnieku uzmanība tika pievērsta MSC lomas izpētei kā skeleta audu cilmes avotam. Jaunākie dati liecina par negaidītu kaulu smadzeņu stromas šūnu diferenciācijas potenciālu ar neironu vai muskuļu audu veidošanos. Citiem vārdiem sakot, mezenhimālajām cilmes šūnām piemīt transgermāla plastiskums - spēja diferencēties šūnu tipos, kas fenotipiski nav saistīti ar sākotnējo audu šūnām. Vienlaikus daži kaulu smadzeņu stromas šūnu bioloģijas aspekti joprojām ir neskaidri un neatrisināti gan vispārējā bioloģiskā ziņā, gan atsevišķās detaļās, tostarp kaulu smadzeņu stromas šūnu identifikācija, daba, izcelsme, attīstība un funkcija in vivo, kā arī pieļaujamais diferenciācijas potenciāls ex vivo un terapeitiskās izmantošanas iespējas in vivo. Iegūtie dati par MSC potenciālu, kā arī citu cilmes šūnu reģeneratīvā potenciāla pētījumu rezultāti ir krasā pretrunā ar bioloģijā iedibinātajām dogmām.

Kultivējot zemā blīvumā, kaulu smadzeņu stromas cilmes šūnas veido atšķirīgas kolonijas, katra no kurām ir iegūta no vienas cilmes šūnas. Stromas cilmes šūnu procentuālais daudzums kodolīgajās kaulu smadzeņu šūnās, ko nosaka koloniju veidošanas spēja, ir ļoti atkarīgs gan no kultivēšanas apstākļiem, gan MSC sugām. Piemēram, grauzējiem apstarotu kaulu smadzeņu barotnes šūnu un seruma klātbūtne kultūrā ir absolūti nepieciešama, lai iegūtu maksimālu stromas cilmes šūnu skaitu, savukārt cilvēkiem mezenhimālo cilmes šūnu koloniju veidošanas efektivitāte nav atkarīga ne no barotnes, ne no barotnes. Zināmo mitogēno faktoru skaits, kas stimulē stromas cilmes šūnu proliferāciju, ir ierobežots. Tie ietver PDGF, EGF, FGF, TGF-b un IGF1. Optimālos kultivēšanas apstākļos poliklonālās MSC līnijas in vitro var izturēt vairāk nekā 50 šūnu dalīšanos, ļaujot iegūt miljardiem kaulu smadzeņu stromas šūnu no 1 ml tās aspirāta.

Tomēr kaulu smadzeņu stromas šūnu populācija ir heterogēna, kas izpaužas gan koloniju izmēru mainīgumā, gan atšķirīgā to veidošanās ātrumā, gan šūnu morfoloģijas daudzveidībā, kas aptver diapazonu no fibroblastiem līdzīgām vārpstveida līdz lielām plakanām šūnām. Šādu kultūru attīstības laikā pēc 20 dienām tiek atzīmēta arī fenotipiskā heterogenitāte. Dažām kolonijām raksturīga augsta sārmainās fosfatāzes ekspresija, citām tā vispār nav, un trešā tipa kolonijas ir fosfatāzes pozitīvas centrālajā reģionā un fosfatāzes negatīvas perifērijā. Atsevišķas kolonijas veido kaulu audu mezgliņus (matricas mineralizācijas sākumu iezīmē iekrāsošana ar alizarīna sarkano vai kalciju saskaņā ar Van Koss). Citās kolonijās notiek tauku uzkrāšanās, ko identificē ar G-krāsošanu ar eļļas sarkano. Retāk mezenhimālo cilmes šūnu kolonijas veido skrimšļus, kas iekrāsoti ar Alciāna zilo krāsu.

Pēc ektopiskas transplantācijas eksperimentālos dzīvniekos poliklonālās MGK līnijas veido ektopisku kaulu ar retikulāru stromu, kas saistīta ar mielopoēzi un adipocītiem, retāk ar skrimšļa audiem. Transplantējot kaulu smadzeņu stromas šūnu monoklonālās līnijas, dažos gadījumos tiek novērots himērisms, kurā de novo kauls sastāv no kaulu audu šūnām, satur donora izcelsmes stromu un adipocītus, savukārt hematopoētiskās līnijas un asinsvadu sistēmas šūnas ir iegūtas no recipienta.

Šo pētījumu rezultāti apstiprina kaulu smadzeņu stromas cilmes šūnu, no kurām tika iegūta klonālā līnija, cilmes šūnu raksturu. Tie arī norāda, ka ne visas šūnas, kas klonogēnas kultūrā, ir patiesi multipotentas cilmes šūnas. Daži pētnieki uzskata, un mēs piekrītam viņu viedoklim, ka visuzticamāko informāciju par atsevišķu klonu reālo diferenciācijas potenciālu var iegūt tikai in vivo pēc transplantācijas, nevis nosakot to atvasinājumu fenotipu in vitro. Osteo-, hondro- vai adipoģenēzes fenotipisko marķieru ekspresija kultūrā (noteikta ar mRNS vai histoķīmiskām metodēm) un pat mineralizētas matricas veidošanās neatspoguļo atsevišķa klona pluripotences pakāpi in vivo. Tāpēc cilmes šūnu identificēšana stromas šūnu grupā ir iespējama tikai a posteriori, atbilstošos bioloģiskās transplantācijas testa apstākļos. Jo īpaši hondroģenēze ļoti reti tiek novērota atklātās transplantācijas sistēmās, savukārt skrimšļu veidošanās nebūt nav nekas neparasts slēgtās sistēmās, piemēram, difūzijas kamerās vai stromas šūnu in vitro mikromasas kultūrās, kur tiek panākts lokāls zems skābekļa spiediens, kas veicina skrimšļa audu veidošanos. Tāpēc pat transplantācijas tehnika, kā arī nespecifiski in vitro kultivēšanas apstākļi būtiski ietekmē MSC diferenciācijas diapazonu.

Eksperimentāla transplantācija noteiktos eksperimentālos apstākļos ir zelta standarts kaulu smadzeņu stromas šūnu diferenciācijas potenciāla noteikšanai un galvenais elements to identificēšanā. Vēsturiski pētījumi par kaulu smadzeņu stromas šūnu transplantāciju ir saistīti ar vispārējo kaulu smadzeņu transplantācijas problēmu. Ir noskaidrots, ka hematopoētiskā mikrovide tiek izveidota, transplantējot kaulu smadzeņu stromas šūnu līnijas, un tā nodrošina hematopoētisko audu ektopisku attīstību transplantācijas zonā. Mikrovides izcelsme no donora un hematopoētisko audu izcelsme no saimnieka ļauj mums uzskatīt ektopisku kaulu par patiesu "apgrieztu" kaulu smadzeņu transplantāciju. Kaulu smadzeņu stromas šūnu lokāla transplantācija veicina efektīvu kaulu defektu korekciju, kas ir izteiktāka nekā spontānas reparatīvas reģenerācijas gadījumā. Vairāki preklīniskie pētījumi ar eksperimentāliem modeļiem ir pārliecinoši pierādījuši kaulu smadzeņu stromas šūnu transplantācijas izmantošanas iespēju ortopēdijā, lai gan šo metožu optimizēšanai ir nepieciešams visrūpīgākais darbs un analīze pat vienkāršākajos gadījumos. Jo īpaši vēl nav noteikti optimālie apstākļi osteogēno stromas šūnu paplašināšanai ex vivo, ideālā nesēja struktūra un sastāvs, kā arī šūnu skaits, kas nepieciešams apjomīgai kaulu reģenerācijai, joprojām nav attīstīts.

Papildus ex vivo paplašinātu kaulu smadzeņu stromas šūnu izmantošanai mezenhimālas izcelsmes audu reģenerācijai, MSC netradicionālā plastiskums paver potenciālus pielietojumus neironu šūnu reģenerācijai vai gēnu produktu piegādei CNS. Principā tas vienkāršo šūnu terapiju nervu sistēmas bojājumu gadījumā, jo nav nepieciešams iegūt autologas cilvēka neironu cilmes šūnas. Ir ziņots par potenciālu kaulu smadzeņu šūnu pielietojumu gan patiesas stromas, gan ekstrastromas izcelsmes kardiomiocītu un miogēnu cilmes šūnu ģenerēšanai.

Tiek veikti eksperimenti par kaulu smadzeņu stromas šūnu sistēmisku transplantāciju bieži sastopamu skeleta slimību ārstēšanai. Nav šaubu, ka kaulu smadzeņu stromas šūnas ir populācija, kas atbild par ģenētiskiem traucējumiem skeleta slimībās, ko labi ilustrē ģenētiskās informācijas vektoru pārnešana, izmantojot šīs šūnas, kas noved pie patoloģisku kaulu audu veidošanās eksperimentāliem dzīvniekiem. Tomēr stromas šūnu spēja implantēties, iesakņoties, vairoties un diferencēties skeleta kaulos pēc ievadīšanas vispārējā asinsritē vēl nav pierādīta.

Tas daļēji ir tāpēc, ka standarta kaulu smadzeņu transplantācijā stroma netiek transplantēta kopā ar hematopoētiskajiem audiem, tāpēc stingri kritēriji sistēmiski ievadītu stromas šūnu veiksmīgas iesakņošanās novērtēšanai vēl nav izstrādāti. Jāatceras, ka marķieru gēnu klātbūtne audu ekstraktos vai donoru izcelsmes šūnu izolēšana kultūrā neliecina par šūnu iesakņošanos, bet tikai par to izdzīvošanu. Pat kaulu smadzeņu stromas šūnu intraarteriāla injekcija peles ekstremitātē var novest pie praktiski nulles iesakņošanās, neskatoties uz to, ka donoru izcelsmes šūnas kaulu smadzeņu mikrovaskulatūrā ir atrodamas lielā skaitā. Diemžēl šādas šūnas parasti tiek raksturotas kā "iesakņojušās", vienkārši pamatojoties uz donoru šūnu marķieru gēnu noteikšanu ex vivo kultūrā. Turklāt ir jāsniedz pārliecinoši pierādījumi par diferencētu un funkcionāli aktīvu donoru izcelsmes šūnu ilgtermiņa integrāciju pētāmajos audos. Daudzos publicētos rakstos, kuros ziņots par kaulu smadzeņu stromas šūnu iesakņošanos skeletā, ir pārsteidzošs šāda veida skaidru datu trūkums. Tomēr jāatzīmē, ka daži pareizi eksperimenti ar dzīvniekiem patiešām ir pierādījuši ierobežotu, bet reālu stromas cilmes šūnu iesakņošanos pēc to sistēmiskas ievadīšanas.

Šie dati saskan ar pētījumu rezultātiem par iespēju piegādāt kaulu smadzeņu miogēnās cilmes šūnas muskuļiem caur asinsvadu sistēmu. Tomēr nedrīkst aizmirst, ka gan skeleta, gan muskuļu audi veidojas attīstības un augšanas laikā, pamatojoties uz ekstravaskulārām šūnu kustībām, kurās tiek izmantoti migrācijas procesi, kas neietver asinsriti. Ja pastāv neatkarīgs asinsrites ceļš cilmes šūnu piegādei cietfāzes audos, vai var pieņemt, ka pastāv fizioloģiski cirkulējošas mezenhimālās cilmes šūnas? Kāda ir šo šūnu izcelsme gan attīstošajā, gan postnatālajā organismā, un kā tās iekļūst asinsvadu sieniņā? Šo jautājumu risinājums šķiet absolūti nepieciešams un prasa visrūpīgāko preklīnisko analīzi. Pat pēc atbilžu atrašanas uz šiem jautājumiem paliks neatrisināti problemātiskie kinētiskie aspekti, kas saistīti ar skeleta augšanu un saistaudu remodelāciju. Tajā pašā laikā osteoģenēzes traucējumu ārstēšana, aizstājot visu mutēto skeleta cilmes šūnu populāciju ar veseliem stromas elementiem, šķiet reāla klīniska perspektīva. Šajā gadījumā lokālas lūzuma zonas vai deformācijas patoloģiskas osteoģenēzes dēļ, kā arī destruktīvas izmaiņas kaulu audos var koriģēt, izmantojot in vitro kultivētas stromas cilmes šūnas. Tāpēc ieteicams turpmākajos pētījumos koncentrēties uz autologu mutētu osteogēnu cilmes šūnu transformācijas vai ģenētiskās korekcijas problēmām ex vivo.

Šūnu ģenētiskā inženierija, īslaicīga vai pastāvīga, ir kļuvusi par šūnu un molekulārās bioloģijas pamatu, daudzu zinātnisku atklājumu avotu par atsevišķu olbaltumvielu lomu šūnu metabolismā in vitro un in vivo. Molekulāro tehnoloģiju izmantošana iedzimtu patoloģiju un cilvēku slimību korekcijai ir ļoti daudzsološa praktiskajā medicīnā, jo kaulu smadzeņu stromas cilmes šūnu īpašības ļauj izstrādāt unikālas transplantācijas shēmas skeleta ģenētisko slimību korekcijai. Tajā pašā laikā mezenhimālās prekursoršūnas var viegli iegūt no nākamā recipienta, tās ir pakļautas ģenētiskām manipulācijām un spēj īsā laikā vairoties lielos daudzumos. Mezenhimālo cilmes šūnu izmantošana ļauj izvairīties no ierobežojumiem un riskiem, kas saistīti ar ģenētiskās informācijas materiāla piegādi tieši pacientam, izmantojot intravaskulāras vektoru konstrukcijas. Līdzīga stratēģija ir piemērojama arī embrionālajām cilmes šūnām, taču autologas pēcdzemdību kaulu smadzeņu stromas šūnas ir vēlamāks materiāls, jo to ievadīšana izslēdz iespējamās imunoloģiskās pēctransplantācijas komplikācijas. Lai sasniegtu īslaicīgu efektu, piemēram, paātrinātu kaulu reģenerāciju, optimālākā metode ir mezenhimālo cilmes šūnu ģenētiskā modifikācija, izmantojot elektroporāciju, ķīmisko saplūšanu, lipofekciju, plazmīdas un adenovīrusu konstrukcijas. Jo īpaši vīrusu transfekcija kaulu smadzeņu stromas šūnās BMP-2 ir pierādījusi savu efektivitāti kaulu reģenerācijas paātrināšanā eksperimentālās politraumas gadījumā. Adenovīrusu vektoru konstrukciju izveide ir vēlama toksicitātes trūkuma dēļ. Tomēr kaulu smadzeņu stromas šūnu ģenētiskā modifikācija šajā gadījumā ir raksturīga ar ārkārtīgi zemu stabilitāti. Turklāt normālām transformētām kaulu smadzeņu stromas šūnām ir nepieciešams izmantot ģenētiskās informācijas vektoru nesējus, kas ir 10 reizes infekciozāki nekā citi šūnu tipi, kas ievērojami palielina transfektēto šūnu nāves procentuālo daļu.

Recesīvu slimību, ko izraisa noteiktu gēnu zema vai nulle bioloģiskā aktivitāte, ārstēšanai nepieciešama ilgstoša vai pastāvīga mezenhimālo cilmes šūnu modifikācija, kam nepieciešams izmantot adeno-asociētos vīrusus, retrovīrusus, lentivīrusus vai adeno-retrovīrusu himēras. Šo vīrusu transporta reģioni spēj pārnest lielus DNS transfektus (līdz 8 kb). Zinātniskajā literatūrā jau ir ziņots par kaulu smadzeņu stromas šūnu, kas transfektētas ar retrovīrusu konstrukcijām, kas kodē regulējošo un marķieru molekulu - IL-3, CD2, VIII faktora, kā arī L-DOPA sintēzē iesaistīto enzīmu - sintēzi, eksogēnu bioloģisko aktivitāti. Tomēr pat šajos pētījumos autori norāda uz vairākiem ierobežojumiem, kas jāpārvar pirms šīs tehnoloģijas praktiskas pielietošanas. Pirmā problēma ir MSC modifikācijas procesa optimizācija ex vivo. Ir zināms, ka kaulu smadzeņu stromas šūnu ilgstoša (3-4 nedēļas) proliferācija in vitro samazina to transfekciju. Tajā pašā laikā, lai sasniegtu augstu MSC ģenētiskās modifikācijas līmeni, ir jāveic vairāki transfekcijas cikli. Otra problēma ir saistīta ar terapeitiskās gēnu ekspresijas ilgumu, kas vēl nepārsniedz četrus mēnešus. Dabisks efektīvās gēnu ekspresijas samazinājums ir saistīts ar promotoru inaktivāciju un modificētu šūnu nāvi. Ņemot vērā vispārējās ģenētiskās informācijas pārneses perspektīvas, izmantojot mezenhimālās cilmes šūnas, sākotnējo pētījumu rezultāti liecina par nepieciešamību pēc turpmākas ex vivo transfekcijas metožu optimizācijas, atbilstoša promotora izvēles, kas regulē bioloģisko aktivitāti vēlamajā virzienā, un modificētu kaulu smadzeņu stromas šūnu spējas palielināšanās pašrezervēties in vivo pēc transplantācijas. Jāatzīmē, ka retrovīrusu konstrukciju izmantošana kaulu smadzeņu stromas šūnu modificēšanai vēlamajā virzienā ne vienmēr prasa to obligātu engraftēšanu. Transfektētās mezenhimālās cilmes šūnas var veikt koriģējošu funkciju stabilas rezidences fonā un bez obligātas aktīvas fiziskas iekļaušanās un funkcionēšanas saistaudos. Šajā gadījumā tās jāuzskata par bioloģisku mini sūkni, kas in vivo ražo faktoru, kura deficīts nosaka ģenētiskās patoloģijas izpausmi.

Transformētu kaulu smadzeņu stromas šūnu izmantošana dominējošās ģenētiskās patoloģijas ārstēšanai, ko raksturo gēna ar patoloģisku vai patoloģisku bioloģisko aktivitāti ekspresija, ir daudz problemātiskāka, jo šajā gadījumā ir jābloķē sagrozītas ģenētiskās informācijas pārnešana vai ieviešana. Viena no ģenētiskās inženierijas metodēm ir embrionālo cilmes šūnu homologā rekombinācija, lai radītu transgēnus dzīvniekus. Tomēr ārkārtīgi zemā homologās rekombinācijas pakāpe apvienojumā ar šādu rekombinantu identifikācijas, atdalīšanas un paplašināšanas problēmām, visticamāk, neveicinās šīs metodes plašu izmantošanu tuvākajā nākotnē, pat ja tiks izstrādātas jaunas tehnoloģiskās metodes. Otrā pieeja dominējošās patoloģijas gēnu terapijā balstās uz bojātas DNS automātisku korekciju, jo ģenētiskās mutācijas var koriģēt, ievadot eksogēnu DNS ar vēlamo secību (īsus DNS oligonukleotīdus vai himēriskus RNS/DNS oligonukleotīdus), kas saistās ar homologiem bojātajā genomā. Trešā iespēja ietver patoloģiskās informācijas pārraides bloķēšanu, kas tiek panākta, izmantojot speciāli izstrādātus oligonukleotīdus, kas saistās ar noteiktu gēnu, veidojot trīskāršu spirālveida struktūru, kas novērš transkripcijas iespēju.

Lai gan ģenētiskas slimības korekcija genoma līmenī joprojām ir optimālākā un vēlamākā terapeitiskā metode, mRNS ir arī daudzsološs vektors (iespējams, pat pieejamāks) dominējošā negatīvā gēna bloķēšanai. Olbaltumvielu molekulas ar antisensu oligonukleotīdiem vai pilnām sekvencēm, kas bloķē mRNS saistīšanos ar šūnu biosintēzes aparātu, jau sen tiek izmantotas, lai kavētu translāciju un/vai palielinātu mRNS degradāciju. Turklāt divpavedienu RNS izraisa strauju mRNS degradāciju, kuras mehānisms joprojām nav skaidrs. Tomēr maz ticams, ka vienkārša mRNS, kas transkribētas no mutanta alēles ar īsām vai atsevišķām mutācijām, eliminācija veicinās normālās alēles mRNS ekspresiju. Alternatīva ir āmura galvas un matadata ribosintēžu izmantošana, kurām piemīt spēja saistīties ar ļoti specifiskiem mRNS reģioniem, pēc tam inducējot to šķelšanos un inaktivāciju translācijas laikā. Pašlaik tiek pētīta šīs metodes izmantošanas iespēja patoloģiskas osteoģenēzes terapijā. Neatkarīgi no tā, kas tieši ir mērķis – genomiskie vai citoplazmas elementi, jauno gēnu terapijas tehnoloģiju panākumus noteiks reaģentu iekļaušanas efektivitāte kaulu smadzeņu stromas šūnās ex vivo, optimāla specifiskā vektora izvēle un mezenhimālo cilmes šūnu stabilā spēja ekspresēt nepieciešamos faktorus in vivo.

Tādējādi mezenhimālo cilmes šūnu atklāšana ar to negaidītajām īpašībām rada jaunu konceptuālu shēmu šūnu līniju attīstībai. Tomēr ir nepieciešami turpmāki starpdisciplināri pētījumi, lai izprastu stromas cilmes šūnu bioloģisko lomu, to dabu, spēju transdiferencēties vai dediferencēties, to fizioloģisko nozīmi embrionālās attīstības, postnatālās augšanas, nobriešanas un novecošanās laikā, kā arī cilvēku slimību gadījumā.