Mākslīgie sirds vārstuļi

Mūsdienu bioloģiskie mākslīgie sirds vārstuļi, kas pieejami klīniskai lietošanai, izņemot plaušu autotransplantātu, ir dzīvotnespējīgas struktūras, kurām trūkst augšanas un audu reparācijas potenciāla. Tas rada būtiskus ierobežojumus to izmantošanai, īpaši bērniem, vārstuļu patoloģijas korekcijai. Audu inženierija ir attīstījusies pēdējo 15 gadu laikā. Šī zinātniskā virziena mērķis ir mākslīgos apstākļos radīt tādas struktūras kā mākslīgie sirds vārsti ar tromborezistentu virsmu un dzīvotspējīgu intersticiālu.

[ 1 ], [ 2 ]

Kā tiek izstrādāti mākslīgie sirds vārsti?

Audu inženierijas zinātniskā koncepcija balstās uz ideju par dzīvu šūnu (fibroblastu, cilmes šūnu utt.) populāciju un audzēšanu sintētiskā vai dabiskā absorbējamā karkasā (matricā), kas ir trīsdimensiju vārstu struktūra, kā arī signālu izmantošanu, kas regulē gēnu ekspresiju, organizāciju un transplantēto šūnu produktivitāti ārpusšūnu matricas veidošanās periodā.

Šādi mākslīgie sirds vārstuļi tiek integrēti ar pacienta audiem, lai pilnībā atjaunotu un tālāk saglabātu to struktūru un funkcijas. Šajā gadījumā šūnu (fibroblastu, miofibroblastu u.c.) darbības rezultātā uz sākotnējās matrices veidojas jauns kolagēna-elastīna karkass jeb, precīzāk sakot, ārpusšūnu matrica. Tā rezultātā optimāliem, ar audu inženierijas palīdzību izveidotiem mākslīgiem sirds vārstiem anatomiskās struktūras un funkcijas ziņā jābūt tuviem dabiskajiem, kā arī tiem jābūt biomehāniskai pielāgošanās spējai, spējai atjaunoties un augt.

Audu inženierija izstrādā mākslīgos sirds vārstus, izmantojot dažādus šūnu savākšanas avotus. Tādējādi var izmantot ksenogēnas vai allogēnas šūnas, lai gan pirmās ir saistītas ar zoonožu pārnešanas risku cilvēkiem. Ir iespējams samazināt antigēniskumu un novērst organisma atgrūšanas reakcijas, ģenētiski modificējot allogēnas šūnas. Audu inženierijai ir nepieciešams uzticams šūnu avots. Šāds avots ir autogēnas šūnas, kas ņemtas tieši no pacienta un atkārtotas implantācijas laikā nerada imūnreakcijas. Efektīvi mākslīgie sirds vārsti tiek ražoti, pamatojoties uz autologām šūnām, kas iegūtas no asinsvadiem (artērijām un vēnām). Tīru šūnu kultūru iegūšanai ir izstrādāta metode, kuras pamatā ir fluorescences aktivētas šūnu šķirošanas - FACS - izmantošana. Jaukta šūnu populācija, kas iegūta no asinsvadiem, tiek marķēta ar acetilētu, zema blīvuma lipoproteīnu marķieri, kas selektīvi absorbējas endoteliocītu virsmā. Pēc tam endotēlija šūnas var viegli atdalīt no šūnu masas, kas iegūta no asinsvadiem, kas būs gludo muskuļu šūnu, miofibroblastu un fibroblastu maisījums. Šūnu avots, vai tā būtu artērija vai vēna, ietekmēs galīgās konstrukcijas īpašības. Tādējādi mākslīgie sirds vārsti ar matricu, kas iesēta ar venozām šūnām, ir pārāki kolagēna veidošanās un mehāniskās stabilitātes ziņā nekā konstrukcijas, kas iesētas ar arteriālām šūnām. Perifēro vēnu izvēle šķiet ērtāks šūnu savākšanas avots.

Miofibroblastus var iegūt arī no miega artērijām. Tomēr no asinsvadiem iegūtajām šūnām ir ievērojami atšķirīgas īpašības nekā dabiskajām intersticiālajām šūnām. Kā alternatīvu šūnu avotu var izmantot autologas nabassaites šūnas.

Mākslīgie sirds vārsti, kuru pamatā ir cilmes šūnas

Pēdējos gados audu inženierijas progresu ir veicinājusi cilmes šūnu pētniecība. Sarkano kaulu smadzeņu cilmes šūnu izmantošanai ir savas priekšrocības. Jo īpaši biomateriālu savākšanas un in vitro kultivēšanas vienkāršība ar sekojošu diferenciāciju dažāda veida mezenhimālajās šūnās ļauj izvairīties no veselu asinsvadu izmantošanas. Cilmes šūnas ir pluripotenti šūnu līniju avoti un tām piemīt unikālas imunoloģiskās īpašības, kas veicina to stabilitāti allogēnos apstākļos.

Cilvēka sarkano kaulu smadzeņu cilmes šūnas iegūst ar krūšu kaula punkciju vai gūžas kaula punkciju. Tās tiek izolētas no 10–15 ml krūšu kaula aspirāta, atdalītas no citām šūnām un kultivētas. Sasniedzot nepieciešamo šūnu skaitu (parasti 21–28 dienu laikā), tās tiek iesētas (kolonizētas) uz matricām un kultivētas barības vielu vidē statiskā stāvoklī (7 dienas mitrinātā inkubatorā 37 °C temperatūrā 5% CO2 klātbūtnē). Pēc tam šūnu augšana tiek stimulēta, izmantojot barības vielu vidi (bioloģiskie stimuli) vai radot fizioloģiskus apstākļus audu augšanai to izometriskās deformācijas laikā reprodukcijas aparātā ar pulsējošu plūsmu – bioreaktorā (mehāniskie stimuli). Fibroblasti ir jutīgi pret mehāniskiem stimuliem, kas veicina to augšanu un funkcionālo aktivitāti. Pulsējošā plūsma izraisa gan radiālo, gan apļveida deformāciju palielināšanos, kas noved pie apdzīvoto šūnu orientācijas (pagarinājuma) šādu spriegumu virzienā. Tas savukārt noved pie orientētu vārstuļu šķiedru struktūru veidošanās. Pastāvīga plūsma rada tikai tangenciālus spriegumus uz sieniņām. Pulsējošajai plūsmai ir labvēlīga ietekme uz šūnu morfoloģiju, proliferāciju un ekstracelulārās matrices sastāvu. Barības vielas plūsmas raksturs, fizikāli ķīmiskie apstākļi (pH, pO2 un pCO2) bioreaktorā būtiski ietekmē arī kolagēna ražošanu. Tādējādi laminārā plūsma, cikliskās virpuļstrāvas palielina kolagēna ražošanu, kas uzlabo mehāniskās īpašības.

Vēl viena pieeja audu struktūru audzēšanai ir embrionālu apstākļu radīšana bioreaktorā, nevis cilvēka ķermeņa fizioloģisko apstākļu simulēšana. Uz cilmes šūnu bāzes audzētiem audu biovārstiem ir kustīgi un elastīgi atloki, kas funkcionāli spēj darboties augsta spiediena un plūsmas ietekmē, kas pārsniedz fizioloģisko līmeni. Šo struktūru atloku histoloģiskie un histoķīmiskie pētījumi parādīja aktīvus matricas biodestrukcijas procesus un to aizstāšanu ar dzīvotspējīgiem audiem. Audi ir organizēti pēc slāņainā tipa ar ārpusšūnu matricas olbaltumvielu īpašībām, kas līdzīgas dabisko audu īpašībām, I un III tipa kolagēna un glikozaminoglikānu klātbūtni. Tomēr tipiskā atloku trīs slāņu struktūra - kambaru, porainais un šķiedrainais slānis - netika iegūta. ASMA pozitīvām šūnām, kas ekspresē vimentīnu, kas atrodamas visos fragmentos, bija līdzīgas miofibroblastu īpašības. Elektronmikroskopija atklāja šūnu elementus ar dzīvotspējīgiem, sekrēcijas aktīviem miofibroblastiem raksturīgām pazīmēm (aktīna/miozīna pavedieni, kolagēna pavedieni, elastīns), un endotēlija šūnas uz audu virsmas.

Uz lapiņām tika konstatēts I un III tipa kolagēns, ASMA un vimentīns. Audu un dabisko struktūru lapiņu mehāniskās īpašības bija salīdzināmas. Audu mākslīgie sirds vārsti 20 nedēļu laikā uzrādīja izcilu veiktspēju un to mikrostruktūrā, bioķīmiskajā profilā un olbaltumvielu matricas veidojumā atgādināja dabiskās anatomiskās struktūras.

Visi audu inženierijas ceļā iegūtie mākslīgie sirds vārsti dzīvniekiem tika implantēti plaušu pozīcijā, jo to mehāniskās īpašības neatbilst slodzēm aortas pozīcijā. No dzīvniekiem eksplantētie audu vārsti pēc struktūras ir tuvi dabiskajiem, kas norāda uz to tālāku attīstību un pārstrukturēšanu in vivo. Vai audu pārstrukturēšanas un nobriešanas process turpināsies fizioloģiskos apstākļos pēc mākslīgo sirds vārstuļu implantācijas, kā tas tika novērots dzīvnieku eksperimentos, parādīs turpmākie pētījumi.

Ideāliem mākslīgajiem sirds vārstuļiem jābūt ar vismaz 90% porainību, jo tas ir svarīgi šūnu augšanai, barības vielu piegādei un šūnu vielmaiņas produktu izvadīšanai. Papildus bioloģiskajai saderībai un bioloģiskajai noārdīšanās spējai mākslīgajiem sirds vārstiem jābūt ar ķīmiski labvēlīgu virsmu šūnu sēšanai un jāatbilst dabisko audu mehāniskajām īpašībām. Matricas bioloģiskās noārdīšanās līmenim jābūt kontrolējamam un proporcionālam jaunu audu veidošanās līmenim, lai laika gaitā nodrošinātu mehānisko stabilitāti.

Pašlaik tiek izstrādātas sintētiskas un bioloģiskas matricas. Visizplatītākie bioloģiskie materiāli matricu veidošanai ir donoru anatomiskās struktūras, kolagēns un fibrīns. Tiek izstrādāti polimēru mākslīgie sirds vārsti, kas pēc implantācijas bioloģiski noārdās, kad implantētās šūnas sāk ražot un organizēt savu ārpusšūnu matricas tīklu. Jaunu matricas audu veidošanos var regulēt vai stimulēt augšanas faktori, citokīni vai hormoni.

[ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Donora mākslīgie sirds vārsti

Kā matricas var izmantot donoru mākslīgos sirds vārstus, kas iegūti no cilvēkiem vai dzīvniekiem un no kuriem ar decelularizācijas palīdzību ir atbrīvoti šūnu antigēni, lai samazinātu to imunogenitāti. Saglabātie ārpusšūnu matrices proteīni ir pamats sekojošai iesēto šūnu adhēzijai. Pastāv šādas šūnu elementu noņemšanas (acelularizācijas) metodes: sasaldēšana, apstrāde ar tripsīnu/EDTA, mazgāšanas līdzekļiem - nātrija dodecilsulfātu, nātrija deoksikolātu, Triton X-100, MEGA 10, TnBR CHAPS, Tween 20, kā arī daudzpakāpju fermentatīvas apstrādes metodes. Šajā gadījumā tiek noņemtas šūnu membrānas, nukleīnskābes, lipīdi, citoplazmas struktūras un šķīstošās matricas molekulas, vienlaikus saglabājot kolagēnu un elastīnu. Tomēr ideāla metode vēl nav atrasta. Tikai nātrija dodecilsulfāts (0,03-1%) vai nātrija deoksikolāts (0,5-2%) nodrošināja pilnīgu šūnu noņemšanu pēc 24 stundu apstrādes.

Dzīvnieku eksperimentā (suņiem un cūkām) izņemto decelularizēto biovārstuļu (alotransplantāta un ksenotransplantāta) histoloģiskā izmeklēšana uzrādīja daļēju endotelizāciju un recipienta miofibroblastu ieaugšanu pamatnē bez kalcifikācijas pazīmēm. Tika novērota mērena iekaisuma infiltrācija. Tomēr decelularizētā SynerGraftTM vārstuļa klīnisko pētījumu laikā attīstījās agrīna mazspēja. Bioprotēzes matricā tika konstatēta izteikta iekaisuma reakcija, kas sākotnēji bija nespecifiska un ko pavadīja limfocītu reakcija. Viena gada laikā attīstījās bioprotēzes disfunkcija un deģenerācija. Matricas šūnu kolonizācija netika konstatēta, bet tika konstatēta vārstuļu kalcifikācija un preimplantācijas šūnu atliekas.

Šūnu nesaturošas matricas, kas iesētas ar endotēlija šūnām un kultivētas in vitro un in vivo, veidoja koherentu slāni uz vārstuļu virsmas, un iesētās dabiskās struktūras intersticiālās šūnas demonstrēja spēju diferencēties. Tomēr bioreaktora dinamiskos apstākļos nebija iespējams sasniegt nepieciešamo fizioloģisko šūnu kolonizācijas līmeni uz matricas, un implantētajiem mākslīgajiem sirds vārstiem bija raksturīga diezgan strauja (trīs mēneši) sabiezēšana paātrinātas šūnu proliferācijas un ārpusšūnu matricas veidošanās dēļ. Tādējādi šajā posmā donoru šūnu nesaturošu matricu izmantošanai to kolonizācijai ar šūnām ir vairākas neatrisinātas problēmas, tostarp imunoloģiskas un infekciozas; darbs pie decelularizētām bioprotezēm turpinās.

Jāatzīmē, ka kolagēns ir arī viens no potenciālajiem bioloģiskajiem materiāliem bioloģiski noārdāmu matricu ražošanai. To var izmantot putu, želejas vai plākšņu, sūkļu veidā un kā šķiedru sagatavi. Tomēr kolagēna izmantošana ir saistīta ar vairākām tehnoloģiskām grūtībām. Jo īpaši to ir grūti iegūt no pacienta. Tāpēc pašlaik lielākā daļa kolagēna matricu ir dzīvnieku izcelsmes. Lēna dzīvnieku kolagēna bioloģiskā noārdīšanās var palielināt inficēšanās risku ar zoonozēm, izraisīt imunoloģiskas un iekaisuma reakcijas.

Fibrīns ir vēl viens bioloģisks materiāls ar kontrolētām biodegradācijas īpašībām. Tā kā no pacienta asinīm var izgatavot fibrīna želejas, lai pēc tam ražotu autologu matricu, šādas struktūras implantācija neizraisīs tā toksisku degradāciju un iekaisuma reakciju. Tomēr fibrīnam ir tādi trūkumi kā difūzija un izskalošanās vidē, kā arī zemas mehāniskās īpašības.

[ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Mākslīgie sirds vārsti, kas izgatavoti no sintētiskiem materiāliem

Arī mākslīgie sirds vārsti tiek izgatavoti no sintētiskiem materiāliem. Vairāki mēģinājumi ražot vārstuļu matricas balstījās uz poliglaktīna, poliglikolskābes (PGA), polipienskābes (PLA), PGA un PLA kopolimēra (PLGA) un polihidroksialkanoātu (PHA) izmantošanu. Ļoti porainu sintētisko materiālu var iegūt no pītas vai nepītas šķiedras un izmantojot sāls izskalošanas tehnoloģiju. Daudzsološs kompozītmateriāls (PGA/P4HB) matricu ražošanai tiek iegūts no nepītām poliglikolskābes (PGA) cilpām, kas pārklātas ar poli-4-hidroksibutirātu (P4HB). No šī materiāla izgatavotie mākslīgie sirds vārsti tiek sterilizēti ar etilēnoksīdu. Tomēr šo polimēru cilpu ievērojamā sākotnējā stingrība un biezums, to straujā un nekontrolētā degradācija, ko pavada skābu citotoksisku produktu izdalīšanās, prasa turpmākus pētījumus un citu materiālu meklēšanu.

Autologu miofibroblastu audu kultūras plākšņu izmantošana, kultivējot uz karkasa, lai veidotu atbalsta matricas, stimulējot šo šūnu veidošanos, ir ļāvusi iegūt vārstuļu paraugus ar aktīvām dzīvotspējīgām šūnām, ko ieskauj ekstracelulāra matrica. Tomēr šo vārstuļu audu mehāniskās īpašības joprojām nav pietiekamas to implantācijai.

Nepieciešamo veidojamā vārstuļa proliferācijas un audu reģenerācijas līmeni, iespējams, nevar sasniegt, tikai apvienojot šūnas un matricu. Šūnu gēnu ekspresiju un audu veidošanos var regulēt vai stimulēt, pievienojot matricām un karkasiem augšanas faktorus, citokīnus vai hormonus, mitogēnus faktorus vai adhēzijas faktorus. Tiek pētīta iespēja ievadīt šos regulatorus matricas biomateriālos. Kopumā ievērojami trūkst pētījumu par audu vārstuļu veidošanās regulēšanu ar bioķīmiskiem stimuliem.

Acelulārā cūku ksenogēnā plaušu bioprotēze Matrix P sastāv no decelularizētiem audiem, kas apstrādāti ar īpašu patentētu AutoTissue GmbH procedūru, tostarp apstrādi ar antibiotikām, nātrija deoksiholātu un spirtu. Šī Starptautiskās standartizācijas organizācijas apstiprinātā apstrādes metode likvidē visas dzīvās šūnas un postšūnu struktūras (fibroblastus, endotēlija šūnas, baktērijas, vīrusus, sēnītes, mikoplazmu), saglabā ekstracelulārās matrices arhitektūru, samazina DNS un RNS līmeni audos līdz minimumam, kas samazina līdz nullei cūku endogēnā retrovīrusa (PERV) pārnešanas varbūtību cilvēkiem. Matrix P bioprotēze sastāv tikai no kolagēna un elastīna ar saglabātu strukturālo integrāciju.

Aitu eksperimentos 11 mēnešus pēc Matrix P bioprotēzes implantācijas tika reģistrēta minimāla apkārtējo audu reakcija ar labiem izdzīvošanas rādītājiem, kas bija īpaši redzami endokarda spīdīgajā iekšējā virsmā. Iekaisuma reakcijas, vārstuļu lapiņu sabiezēšana un saīsināšanās praktiski nebija novērojamas. Tika reģistrēts arī zems audu kalcija līmenis Matrix P bioprotēzes gadījumā, un atšķirība bija statistiski nozīmīga, salīdzinot ar tiem, kas tika ārstēti ar glutaraldehīdu.

Mākslīgais sirds vārstulis Matrix P pielāgojas individuālā pacienta stāvoklim dažu mēnešu laikā pēc tā implantācijas. Kontroles perioda beigās veiktajā pārbaudē tika atklāta neskarta ekstracelulārā matrica un saplūstošs endotēlijs. Matrix R ksenotransplantāts, kas tika implantēts 50 pacientiem ar iedzimtiem defektiem Rosas procedūras laikā laikā no 2002. līdz 2004. gadam, uzrādīja labāku veiktspēju un zemākus transvalvulārā spiediena gradientus salīdzinājumā ar kriokonservētiem un decelularizētiem SynerGraftMT allotransplantātiem un ar glutaraldehīdu apstrādātām bezsastām bioprotezēm. Mākslīgie sirds vārstuļi Matrix P ir paredzēti plaušu vārstuļu nomaiņai labā kambara izplūdes trakta rekonstrukcijas laikā iedzimtu un iegūtu defektu ķirurģijā, kā arī plaušu vārstuļu nomaiņas laikā Rosas procedūras laikā. Tie ir pieejami 4 izmēros (pēc iekšējā diametra): jaundzimušajiem (15–17 mm), bērniem (18–21 mm), vidējiem (22–24 mm) un pieaugušajiem (25–28 mm).

Progress audu inženierijas vārstuļu izstrādē būs atkarīgs no sasniegumiem vārstuļu šūnu bioloģijā (tostarp gēnu ekspresijas un regulācijas jautājumos), embriogēnās un ar vecumu saistītās vārstuļu attīstības pētījumiem (tostarp angiogēnajiem un neirogēnajiem faktoriem), precīzām zināšanām par katra vārstuļa biomehāniku, atbilstošu šūnu identificēšanu iesēšanai un optimālu matricu izstrādes. Lai tālāk izstrādātu progresīvākus audu vārstus, būs nepieciešama padziļināta izpratne par saistību starp dabisko vārstuļu mehāniskajām un strukturālajām īpašībām un stimuliem (bioloģiskajiem un mehāniskajiem), lai šīs īpašības atjaunotu in vitro.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]