Enzīmu un citokīnu loma osteoartrīta patoģenēzē

Pēdējos gados pētnieku uzmanība ir pievērsta proteāžu, kas ir atbildīgas par locītavu skrimšļa ECM degradāciju osteoartrīta gadījumā, identificēšanai. Saskaņā ar mūsdienu koncepcijām matricas metaloproteināzēm (MMP) ir svarīga loma osteoartrīta patoģenēzē. Pacientiem ar osteoartrītu tiek konstatēts paaugstināts trīs MMP līmenis - kolagenāzes, stromelizīni un želatināzes. Kolagenāze ir atbildīga par dabīgā kolagēna degradāciju, stromelizīns - IV tipa kolagēna, proteoglikānu un laminīna, želatināze - par želatīna, IV, Vh XI tipa kolagēnu un elastīna degradāciju. Turklāt tiek pieņemts, ka ir vēl viens enzīms - agrekanāze, kam piemīt MMP īpašības un kas ir atbildīga par skrimšļa proteoglikānu agregātu proteolīzi.

Cilvēka locītavu skrimšļos ir identificēti trīs kolagenāžu veidi, kuru līmenis pacientiem ar osteoartrītu ir ievērojami paaugstināts: kolagenāze-1 (MMP-1), kolagenāze-2 (MMP-8) un kolagenāze-3 (MMP-13). Trīs dažādu kolagenāžu veidu līdzāspastāvēšana locītavu skrimšļos liecina, ka katram no tiem ir sava specifiska loma. Patiešām, kolagenāzes-1 un -2 galvenokārt lokalizējas locītavu skrimšļa virspusējā un augšējā starpzonā, savukārt kolagenāze-3 ir atrodama apakšējā starpzonā un dziļajā zonā. Turklāt imūnhistoķīmisko pētījumu rezultāti parādīja, ka, osteoartrītam progresējot, kolagenāzes-3 līmenis sasniedz plato un pat samazinās, savukārt kolagenāzes-1 līmenis pakāpeniski palielinās. Ir pierādījumi, ka osteoartrīta gadījumā kolagenāze-1 galvenokārt ir iesaistīta locītavu skrimšļa iekaisuma procesā, savukārt kolagenāze-3 ir iesaistīta audu remodelācijā. Kolagenāze-3, kas ekspresējas pacientu ar osteoartrītu skrimšļos, intensīvāk noārda II tipa kolagēnu nekā kolagenāze-1.

No otrās metaloproteāžu grupas pārstāvjiem trīs ir identificēti arī cilvēka stromelizīnā: stromelizīns-1 (MMP-3), stromelizīns-2 (MMP-10) un stromelizīns-3 (MMP-11). Mūsdienās ir zināms, ka osteoartrīta patoloģiskajā procesā ir iesaistīts tikai stromelizīns-1. Stromelizīns-2 nav konstatēts pacientu ar osteoartrītu sinoviālajā membrānā, bet tas ļoti nelielā daudzumā ir atrodams pacientu ar reimatoīdo artrītu sinoviālajos fibroblastos. Stromelizīns-3 ir atrodams arī pacientu ar reimatoīdo artrītu sinoviālajā membrānā fibroblastu tuvumā, īpaši fibrozes zonās.

Cilvēka skrimšļa audu želatināžu grupā ir identificētas tikai divas: 92 kD želatināze (želatināze B jeb MMP-9) un 72 kD želatināze (želatināze A jeb MMP-2); pacientiem ar osteoartrītu tiek noteikts 92 kD želatināzes līmeņa paaugstināšanās.

Nesen ir identificēta vēl viena MMP grupa, kas lokalizējas uz šūnu membrānu virsmas un tiek sauktas par membrānas tipa MMP (MMP-MT). Šajā grupā ietilpst četri enzīmi - MMP-MT1 - MMP-MT-4. MMP-MT ekspresija ir konstatēta cilvēka locītavu skrimšļos. Lai gan MMP-MT-1 piemīt kolagenāzes īpašības, abi enzīmi MMP-MT-1 un MMP-MT-2 spēj aktivizēt želatināzi-72 kDa un kolagenāzi-3. Šīs MMP grupas loma osteoartrīta patoģenēzē ir jānoskaidro.

Proteināzes tiek sekretētas zimogēna veidā, ko aktivizē citas proteināzes vai organiskie dzīvsudraba savienojumi. MMP katalītiskā aktivitāte ir atkarīga no cinka klātbūtnes enzīma aktīvajā zonā.

MMP bioloģisko aktivitāti kontrolē specifiski TIMP. Līdz šim ir identificēti trīs TIMP veidi, kas atrodami cilvēka locītavu audos: TIMP-1–TIMP-3. Ir identificēts un klonēts ceturtais TIMP veids, taču tas vēl nav atklāts cilvēka locītavu audos. Šīs molekulas specifiski saistās ar MMP aktīvo centru, lai gan dažas no tām spēj saistīties ar 72 kD progelatināzes (TIMP-2, -3, -4) un 92 kD progelatināzes (TIMP-1 un -3) aktīvo centru. Pierādījumi liecina, ka osteoartrīta gadījumā locītavu skrimšļos ir nelīdzsvarotība starp MMP un TIMP, kā rezultātā rodas relatīvs inhibitoru deficīts, iespējams, daļēji saistīts ar aktīvo MMP līmeņa paaugstināšanos audos. TIMP-1 un -2 ir atrodami locītavu skrimšļos un tos sintezē hondrocīti. Osteoartrīta gadījumā sinoviālajā membrānā un sinoviālajā šķidrumā tiek atklāts tikai I tipa TIMP. TIMP-3 ir atrodams tikai ārējā membrānas masā (ECM). TIMP-4 aminoskābju secība gandrīz 50% sakrīt ar TIMP-2 un 38% ar TIMP-1. Citās mērķa šūnās TIMP-4 ir atbildīgs par 72 kD progelatināzes aktivācijas modulēšanu uz šūnas virsmas, kas norāda uz svarīgu lomu kā audu specifiskam ECM remodelācijas regulatoram.

Vēl viens mehānisms MMP bioloģiskās aktivitātes kontrolei ir to fizioloģiskā aktivācija. Tiek uzskatīts, ka serīna un cisteīna proteāžu saimes enzīmi, piemēram, attiecīgi AP/plazmīns un katepsīns B, ir MMP fizioloģiskie aktivatori. Osteoartrīta pacientu locītavu skrimšļos ir konstatēts paaugstināts urokināzes (uAP) un plazmīna līmenis.

Neskatoties uz to, ka locītavu audos ir atrodami vairāki katepsīnu veidi, katepsīns-B tiek uzskatīts par visticamāko MMP aktivatoru skrimšļos. Cilvēka locītavu audos ir atrasti serīna un cisteīna proteāžu fizioloģiskie inhibitori. AP-1 inhibitora (IAI-1), kā arī cisteīna proteāžu aktivitāte pacientiem ar osteoartrītu ir samazināta. Līdzīgi kā MMP/TIMP, tieši nelīdzsvarotība starp serīna un cisteīna proteāzēm un to inhibitoriem var izskaidrot MMP paaugstināto aktivitāti locītavu skrimšļos pacientiem ar osteoartrītu. Turklāt MMP spēj aktivizēt viens otru. Piemēram, stromelizīns-1 aktivizē kolagenāzi-1, kolagenāzi-3 un 92 kD želatināzi; kolagenāze-3 aktivizē 92 kD želatināzi; MMP-MT aktivizē kolagenāzi-3, un želatināze-72 kDa pastiprina šo aktivāciju; MMP-MT arī aktivizē želatināzi 72 kDa. Citokīnus var iedalīt trīs grupās - destruktīvie (iekaisuma), regulējošie (ieskaitot pretiekaisuma) un anaboliskie (augšanas faktori).

Citokīnu veidi (saskaņā ar van den Berg WB et al)

Destruktīvs	Interleikīns-1 TNF-α Leikēmijas inhibējošais faktors Interleikīns-17
Normatīvie	Interleikīns-4 Interleikīns-10 Interleikīns-13 Enzīmu inhibitori
Anabolisks	Mansulīnam līdzīgi augšanas faktori TGF-b Kaulu morfogēniskie proteīni Morfogēnie proteīni, kas iegūti no skrimšļiem

Destruktīvie citokīni, jo īpaši IL-1, izraisa proteāžu izdalīšanās palielināšanos un kavē proteoglikānu un kolagēnu sintēzi hondrocītos. Regulējošie citokīni, jo īpaši IL-4 un -10, kavē IL-1 veidošanos, palielina IL-1 receptoru antagonista (IL-1RA) veidošanos un samazina NO sintāzes līmeni hondrocītos. Tādējādi IL-4 neitralizē IL-1 trīs virzienos: 1) samazina veidošanos, novēršot tā iedarbību, 2) palielina galvenā "ķerēja" IL-1RA veidošanos un 3) samazina galvenā sekundārā "kurjera" NO veidošanos. Turklāt IL-4 samazina audu fermentatīvo degradāciju. In vivo optimālais terapeitiskais efekts tiek panākts, kombinējot IL-4 un IL-10. Anaboliskie faktori, piemēram, TGF-β un IGF-1, faktiski netraucē IL-1 ražošanu vai darbību, bet gan uzrāda pretēju aktivitāti, piemēram, stimulējot proteoglikānu un kolagēna sintēzi, nomācot proteāžu aktivitāti, un TGF-β arī kavē enzīmu izdalīšanos un stimulē to inhibitorus.

Iekaisuma citokīni ir atbildīgi par pastiprinātu MMP sintēzi un ekspresiju locītavu audos. Tie tiek sintezēti sinoviālajā membrānā un pēc tam caur sinoviālo šķidrumu difundējas locītavu skrimšļos. Iekaisuma citokīni aktivizē hondrocītus, kas savukārt arī spēj ražot iekaisuma citokīnus. Osteoartrīta skartajās locītavās iekaisuma efektora lomu galvenokārt spēlē sinoviālās membrānas šūnas. Tieši makrofāgu tipa sinovicīti izdala proteāzes un iekaisuma mediatorus. Starp tiem IL-f, TNF-α, IL-6, leikēmijas inhibējošais faktors (LIF) un IL-17 ir visvairāk “iesaistīti” osteoartrīta patoģenēzē.

Bioloģiski aktīvas vielas, kas stimulē locītavu skrimšļa degradāciju osteoartrīta gadījumā

• Interleikīns-1
• Interleikīns-3
• Interleikīns-4
• TNF-α
• Kolonijas stimulējošie faktori: makrofāgi (monocīti) un granulocīti-makrofāgi
• Viela P
• _2. lpp.
• Plazminogēna aktivatori (audu un urokināzes tipa) un plazmīns
• Metaloproteāzes (kolagenāzes, ellastāzes, stromelizīni)
• Katepsīni A un B
• Trilsina
• Baktēriju lipopolisaharīdi
• Fosfolipāzes Ag

Literatūras dati liecina, ka IL-1 un, iespējams, TNF-α ir galvenie locītavu audu destrukcijas mediatori osteoartrīta gadījumā. Tomēr joprojām nav zināms, vai tie darbojas neatkarīgi viens no otra, vai arī starp tiem pastāv funkcionāla hierarhija. Osteoartrīta dzīvnieku modeļi ir parādījuši, ka IL-1 blokāde efektīvi novērš locītavu skrimšļa destrukciju, savukārt TNF-α blokāde tikai samazina iekaisumu locītavu audos. Pacientu sinoviālajā membrānā, sinoviālajā šķidrumā un skrimšļos tika konstatēta abu citokīnu paaugstināta koncentrācija. Hondrocītos tie spēj palielināt ne tikai proteāžu (galvenokārt MMP un AP), bet arī mazāk nozīmīgu kolagēnu, piemēram, I un III tipa, sintēzi un samazināt II un IX tipa kolagēnu un proteoglikānu sintēzi. Šie citokīni stimulē arī reaktīvās skābekļa sugas un iekaisuma mediatorus, piemēram, PGE2 _. Šādu makromolekulāru izmaiņu rezultāts locītavu skrimšļos osteoartrīta gadījumā ir reparatīvo procesu neefektivitāte, kas noved pie turpmākas skrimšļa degradācijas.

Iepriekš minētie proinflamatoriskie citokīni modulē MMP nomākšanas/aktivācijas procesus osteoartrīta gadījumā. Piemēram, nelīdzsvarotība starp TIMP-1 un MMP līmeņiem skrimšļos osteoartrīta gadījumā var būt saistīta ar IL-1, jo in vitro pētījumā tika pierādīts, ka IL-1 beta koncentrācijas palielināšanās izraisa TIMP-1 koncentrācijas samazināšanos un MMP sintēzes palielināšanos hondrocītos. AP sintēzi modulē arī IL-1 beta. Locītavu skrimšļa hondrocītu stimulēšana in vitro ar IL-1 izraisa no devas atkarīgu AP sintēzes palielināšanos un strauju iAP-1 sintēzes samazināšanos. IL-1 spēja samazināt iAP-1 sintēzi un stimulēt AP sintēzi ir spēcīgs plazmīna ģenerēšanas un MMP aktivācijas mehānisms. Turklāt plazmīns ir ne tikai enzīms, kas aktivizē citus enzīmus, bet arī piedalās skrimšļa degradācijas procesā, veicot tiešu proteolīzi.

IL-ip tiek sintezēts kā neaktīvs prekursors ar masu 31 kD (pre-IL-ip), un pēc signālpeptīda šķelšanas tas tiek pārveidots par aktīvu citokīnu ar masu 17,5 kD. Locītavu audos, tostarp sinoviālajā membrānā, sinoviālajā šķidrumā un locītavu skrimšļos, IL-ip ir atrodams aktīvā formā, un in vivo pētījumi ir pierādījuši sinoviālās membrānas spēju osteoartrīta gadījumā izdalīt šo citokīnu. Dažas serīna proteāzes spēj pārveidot pre-IL-ip tā bioaktīvajā formā. Zīdītājiem šādas īpašības tika konstatētas tikai vienai proteāzei, kas pieder pie cisteīna aspartāta specifisko enzīmu saimes un tiek saukta par IL-1β konvertējošo enzīmu (ICF jeb kaspāze-1). Šis enzīms spēj specifiski pārveidot pre-IL-ip par bioloģiski aktīvu "nobriedušu" IL-ip ar masu 17,5 kD. ICF ir 45 kD proenzīms (p45), kas lokalizējas šūnu membrānā. Pēc p45 proenzīma proteolītiskās šķelšanas veidojas divas apakšvienības, kas pazīstamas kā p10 un p20, kurām raksturīga fermentatīva aktivitāte.

TNF-α tiek sintezēts arī kā membrānai saistīts prekursors ar masu 26 kDa; proteolītiskās šķelšanās rezultātā tas tiek atbrīvots no šūnas aktīvā šķīstošā formā ar masu 17 kDa. Proteolītisko šķelšanos veic TNF-α konvertējošais enzīms (TNF-AC), kas pieder pie adamalizīnu saimes. AR Amin et al. (1997) atklāja palielinātu TNF-AC mRNS ekspresiju osteoartrīta pacientu locītavu skrimšļos.

Hondrocītu un sinovocītu bioloģiskā aktivācija ar IL-1 un TNF-α notiek, saistoties ar specifiskiem receptoriem uz šūnas virsmas - IL-R un TNF-R. Katram citokīnam ir identificēti divu veidu receptori - IL-IP I un II tips un TNF-R I tips (p55) un II (p75). IL-1PI un p55 ir atbildīgi par signālu pārraidi locītavu audu šūnās. IL-1R I tipam ir nedaudz lielāka afinitāte pret IL-1beta nekā pret IL-1a; IL-1R II tipam, gluži pretēji, ir lielāka afinitāte pret IL-1a nekā pret IL-ip. Joprojām nav skaidrs, vai IL-IP II tips var mediēt IL-1 signālus, vai arī tas kalpo tikai IL-1 asociācijas ar IL-1R I tipu konkurētspējīgai inhibīcijai. Osteoartrīta pacientu hondroitīdi un sinoviālie fibroblasti satur lielu daudzumu IL-1PI un p55, kas savukārt izskaidro šo šūnu augsto jutību pret stimulāciju ar atbilstošajiem citokīniem. Šis process noved gan pie proteolītisko enzīmu pastiprinātas sekrēcijas, gan locītavu skrimšļa iznīcināšanas.

Nevar izslēgt IL-6 iesaistīšanos osteoartrīta patoloģiskajā procesā. Šis pieņēmums ir balstīts uz šādiem novērojumiem:

• IL-6 palielina iekaisuma šūnu skaitu sinoviālajā membrānā,
• IL-6 stimulē hondrocītu proliferāciju,
• IL-6 pastiprina IL-1 ietekmi, palielinot MMP sintēzi un inhibējot proteoglikānu sintēzi.

Tomēr IL-6 spēj inducēt TIMP veidošanos, bet neietekmē MMP veidošanos, tāpēc tiek uzskatīts, ka šis citokīns ir iesaistīts locītavu skrimšļa proteolītiskās degradācijas inhibēšanas procesā, ko veic ar atgriezeniskās saites mehānismu.

Vēl viens IL-6 saimes loceklis ir LIF, citokīns, ko ražo no osteoartrīta pacientiem iegūti hondrocīti, reaģējot uz stimulāciju ar iekaisumu veicinošiem citokīniem IL-1p un TNF-α. LIF stimulē skrimšļa proteoglikānu rezorbciju, kā arī MMP sintēzi un NO veidošanos. Šī citokīna loma osteoartrītā nav pilnībā noskaidrota.

IL-17 ir 20–30 kD homodimērs ar IL-1 līdzīgu efektu, bet daudz mazāk izteiktu. IL-17 stimulē vairāku iekaisumu veicinošu citokīnu, tostarp IL-1p, TNF-α, IL-6 un MMP, sintēzi un izdalīšanos mērķa šūnās, piemēram, cilvēka makrofāgos. Turklāt IL-17 stimulē NO ražošanu hondrocītos. Tāpat kā LIF, arī IL-17 loma osteoartrīta patoģenēzē ir maz pētīta.

Neorganiskais brīvais radikālis NO spēlē svarīgu lomu locītavu skrimšļa degradācijā osteoartrīta gadījumā. No osteoartrīta pacientiem izolēti hondrocīti ražo lielāku NO daudzumu gan spontāni, gan pēc stimulācijas ar iekaisumu veicinošiem citokīniem, salīdzinot ar normālām šūnām. Augsts NO saturs ir konstatēts pacientu ar osteoartrītu sinoviālajā šķidrumā un serumā - tas ir inducētās NO sintāzes (hNOC), enzīma, kas atbild par NO ražošanu, pastiprinātas ekspresijas un sintēzes rezultāts. Nesen tika klonēta hondrocītiem specifiskā hNOC DNS un noteikta enzīma aminoskābju secība. Aminoskābju secība norāda uz 50% identitāti un 70% līdzību ar endotēlijam un nervu audiem specifisko hNOC.

NO kavē locītavu skrimšļa ECM makromolekulu sintēzi un stimulē MMP sintēzi. Turklāt NO produkcijas palielināšanās ir saistīta ar IL-IP antagonista (IL-1RA) sintēzes samazināšanos hondrocītos. Tādējādi IL-1 līmeņa paaugstināšanās un IL-1RA samazināšanās noved pie NO hiperstimulācijas hondrocītos, kas savukārt noved pie pastiprinātas skrimšļa matrices degradācijas. Ir ziņojumi par selektīva hNOC inhibitora terapeitisko iedarbību in vivo uz eksperimentālas osteoartrīta progresēšanu.

Dabiskie citokīnu inhibitori spēj tieši novērst citokīnu saistīšanos ar šūnu membrānas receptoriem, samazinot to iekaisumu veicinošo aktivitāti. Dabiskos citokīnu inhibitorus var iedalīt trīs klasēs, pamatojoties uz to darbības veidu.

Pirmā inhibitoru klase ietver receptoru antagonistus, kas novērš liganda saistīšanos ar tā receptoru, konkurējot par saistīšanās vietu. Līdz šim šāds inhibitors ir atrasts tikai IL-1 - tas ir iepriekš minētais IL-1/ILIP sistēmas konkurējošais inhibitors IL-1 PA. IL-1 PA bloķē daudzas sekas, kas novērojamas locītavu audos osteoartrīta gadījumā, tostarp prostaglandīnu sintēzi sinoviālajās šūnās, kolagenāzes ražošanu hondrocītos un locītavu skrimšļa kaulu smadzeņu (BM) degradāciju.

IL-1RA ir sastopams dažādās formās – vienā šķīstošā (rIL-1RA) un divās starpšūnu formās (μIL-lPAI un μIL-1RAP). Šķīstošās IL-1RA formas afinitāte ir 5 reizes augstāka nekā starpšūnu formām. Neskatoties uz intensīviem zinātniskiem pētījumiem, pēdējo funkcija joprojām nav zināma. In vitro eksperimenti ir parādījuši, ka IL-1beta aktivitātes inhibēšanai nepieciešama IL-1RA koncentrācija 10–100 reizes lielāka nekā parasti, savukārt in vivo apstākļos ir nepieciešams tūkstoš reižu lielāks IL-1RA koncentrācijas pieaugums. Šis fakts var daļēji izskaidrot IL-1RA relatīvo deficītu un IL-1 pārpalikumu osteoartrīta pacientu sinovijā.

Otra dabisko citokīnu inhibitoru klase ir šķīstošie citokīnu receptori. Šādu inhibitoru piemēri cilvēkiem, kas ir saistīti ar osteoartrīta patoģenēzi, ir rIL-1R un pp55. Šķīstošie citokīnu receptori ir saīsinātas normālu receptoru formas; kad tie saistās ar citokīniem, tie novērš to saistīšanos ar mērķa šūnu membrānām saistītajiem receptoriem, darbojoties ar konkurētspējīga antagonisma mehānismu.

Galvenais šķīstošo receptoru prekursors ir ar membrānu saistīts IL-1RP. rIL-IP afinitāte pret IL-1 un IL-1RA ir atšķirīga. Tādējādi rIL-1RN ir augstāka afinitāte pret IL-1β nekā pret IL-1RA, un rIL-1PI uzrāda lielāku afinitāti pret IL-1RA nekā pret IL-ip.

TNF ir arī divu veidu šķīstošie receptori - pp55 un pp75, tāpat kā šķīstošie IL-1 receptori, tie veidojas, "atdaloties". In vivo abi receptori ir atrodami skarto locītavu audos. Šķīstošo TNF receptoru loma osteoartrīta patogenezē ir diskusiju objekts. Tiek pieņemts, ka zemās koncentrācijās tie stabilizē TNF trīsdimensiju struktūru un palielina bioaktīvā citokīna pusperiodu, savukārt augstas pp55 un pp75 koncentrācijas var samazināt TNF aktivitāti, konkurējot ar antagonismu. Iespējams, pp75 var darboties kā TNF nesējs, atvieglojot tā saistīšanos ar membrānu saistīto receptoru.

Trešo dabisko citokīnu inhibitoru klasi pārstāv pretiekaisuma citokīnu grupa, kas ietver TGF-beta, IL-4, IL-10 un IL-13. Pretiekaisuma citokīni samazina iekaisumu veicinošu un dažu proteāžu veidošanos un stimulē IL-1RA un TIMP veidošanos.