Embrionālās cilmes šūnas

Embrionālo cilmes šūnu atklāšana neradās nejauši, bet gan parādījās uz sagatavotas zinātniskās pētniecības augsnes attīstības bioloģijas jomā. Terminu "cilmes šūnas" medicīnā 1908. gadā Berlīnes hematoloģijas biedrības kongresā ieviesa Aleksandrs Maksimovs saistībā ar hematopoētiskajām šūnām. Ilgi pirms pluripotentu embrionālo cilmes šūnu līniju izolēšanas un ražošanas, agrīnās attīstības procesu pētījumos tika izmantotas terato-(embrija karcinomas) cilmes šūnas, ar kuru palīdzību tika pētīti nezināmi embrioģenēzes mehānismi, tostarp agrīno gēnu ekspresijas secība un to aktivitātes olbaltumvielu produkti.

Bet vai cilvēka genoma totipotence evolūcijas procesā ir neatgriezeniski zudusi? Nē, un embrioģenēze tam ir pierādījums. Ja tā ir, tad kad principā tiks realizēts otrais evolūcijas attīstības ceļš? Iespējams, kad cilvēks nonāks kosmosā, kur vides apstākļi pietiekami ilgu laiku būs relatīvi nemainīgi. Kaulu audu zudumu (kaulu demineralizāciju bezsvara stāvoklī), kas ļoti lēni pakļaujas pārveidošanai un reģenerācijai, var uzskatīt par pirmo soli cilvēka, kā sugas, adaptācijas procesā eksistencei kosmosa apstākļos. Tomēr cena par otro evolūcijas attīstības ceļu būs atšķirīga - cena par totipotences un absolūtās plastiskuma atgriešanos visās šūnās būs sterilitāte. Tātad šajā "evolucionāro hameleonu" pasaulē mums būs jāvairojas bez mejozes, pumpurojoties. Bet mēs dzīvosim ilgi. Telomerāzes nemirstība ir amēbas nemirstība. Daudzšūnu organismā cilmes šūnas ir kvantitatīvas un kvalitatīvas ilgmūžības substrāts.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Embrionālo cilmes šūnu avoti

Mūsdienās embriju cilmes šūnu avoti laboratorijas pētījumiem ir peļu teratokarcinomas līnijas (129/sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, Rl, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) un cilvēka teratokarcinoma (NTERA-2, TERA-2, H-9 klons), kā arī Trauneon ESC līnijas. Tomēr detalizētas šūnu pases pieejamība, kurā norādīts imūnfenotips, hromosomu analīzes rezultāti, mRNS ekspresijas profili, eksponētie receptori un intracelulārie signālproteīni, nekompensē teratokarcinomas ESC līniju būtiskos trūkumus - strauju totipotences zudumu un neiespējamību tās izmantot klīniskajos pētījumos, savukārt jaukta diferenciācija kultūrā ļoti apgrūtina tīras specializētas līnijas izolēšanu no heterogēnas šūnu populācijas. Tāpēc klīniskiem mērķiem izveidoto ESC līniju avots parasti ir blastocistas iekšējā šūnu masa, atsevišķi 8 šūnu stadijas embriju blastomēri, vēlāku stadiju morulas šūnas, kā arī pirmatnējās dzimumšūnas.

Jāatzīmē, ka teratokarcinomas šūnām, lai gan tām piemīt pluripotences īpašība, ir raksturīgs ievērojami zemāks pluripotents potenciāls salīdzinājumā ar ESC. To integrācija ar embrionālajām šūnām reti noved pie himēru veidošanās, kuras turklāt nekad neveido gametas ar teratokarcinomas šūnu genotipu. Tiek uzskatīts, ka tas ir saistīts ar biežu hromosomu anomāliju rašanos teratokarcinomas šūnu kultivēšanas laikā: Y hromosomas zudumu, dažādām trisomijām, delēcijām vai translokācijām.

Ir atkārtoti mēģināts izolēt cilvēka ESC līniju, taču šis uzdevums nav atrisināts, jo normālas cilvēka blastocistas ir grūti pieejamas. Turklāt hromosomu anomāliju biežums cilvēkiem ir augstāks nekā dzīvnieku embrioģenēzē. Lielākajai daļai agrīno cilvēka embriju, kas iegūti pēc in vitro apaugļošanas, ir haotiska hromosomu mozaīka un bieži vien ir skaitliskas un strukturālas aberācijas. Pat vēlāk, blastocistas stadijā, tikai 20–25% cilvēka embriju sastāv no šūnām ar normālu kariotipu. Šādus embrijus praktiski nebija iespējams izmantot ESC izveidei, jo zigotas parasti tika kultivētas līdz divu vai četru blastomēru stadijai un pēc tam transplantētas dzemdē. Tikai salīdzinoši nesen ir izstrādāta uzticama metode apaugļotu cilvēka olšūnu kultivēšanai līdz blastocistas stadijai. Šīs metodes ieviešana in vitro apaugļošanas praksē ir ne tikai palielinājusi veiksmīgu implantācijas rezultātu biežumu, bet arī padarījusi normālas blastocistas par pieejamāku objektu.

Vēl viens pluripotentu cilmes šūnu avots ir pirmatnējās dzimumšūnas, kurām, atšķirībā no attīstītākajām germinālā epitēlija cilmes šūnu populācijām, uz to virsmas nav beta-integrīna, bet tās ekspresē augstu sārmainās fosfatāzes aktivitāti. Jāatzīmē, ka cilmes šūnu populācijas, kas veidojušās no pirmatnējām dzimumšūnām, tiek eksperimentāli pētītas kopš 20. gs. astoņdesmitajiem gadiem. Toreiz tika izstrādāta metode pirmatnējo dzimumšūnu izolēšanai no peles embrija gonādas rudimenta. Pirmie neveiksmīgie pirmatnējo dzimumšūnu kultivēšanas in vitro rezultāti liecināja par šo mēģinājumu veltīgumu, jo šūnas, lai gan izdzīvoja, nevairojās un gāja bojā pirmās dienas laikā. Vēlāk tika noskaidrots, ka peles pirmatnējās dzimumšūnas in vitro vairojas tikai šķīstošu un membrānai saistītu specifisku polipeptīdu augšanas faktoru klātbūtnē barotnē. Daudzu pētījumu rezultāti liecina, ka primāro dzimumšūnu izdzīvošanai un proliferācijai barotnē ir nepieciešams ne tikai LIF, bet arī membrānai saistītu un šķīstošu tērauda faktoru (SIF) klātbūtne. Šos peptīdus ražo embriju somatiskās šūnas, kuriem ir homozigota Stīla mutācija, un viens no tiem ir cKit protoonkogēna ligands.

Zīdītāju un cilvēku primārajām dzimumšūnām ir ekstragonadāla izcelsme un tās ir dzimumšūnu līnijas klonālās attīstības avots. Primitīvās dzimumšūnu līnijas, kā arī visu embrionālo audu un ekstraembrionālās mezodermas izcelsme ir agrīno embriju epiblasts (primārā ektoderma), kam ir mozaīkas strukturāla organizācija. Izmantojot agrīnā embrija dažādu daļu mikroķirurģiskas noņemšanas metodi, tika noteikta primitīvo dzimumšūnu prekursoru klona lokalizācijas zona epiblastā. Izmantojot rodamīna dekstrānu, kas tika izmantots kā šūnu marķieris, tika konstatēts, ka primitīvo dzimumšūnu prekursori ir lokalizēti epiblasta proksimālajā daļā, netālu no ekstraembrionālās ektodermas. Primitīvā dzimumšūnu līnija rodas no 45 šūnu klona, kura izdalīšanās notiek pašā gastrulācijas sākumā. Pēc tam klons atdalās, un gastrulācijas laikā primārās dzimumšūnas nonāk ekstraembrionālajā mezodermā un atrodas alantoisa rudimenta pamatnē, aiz primārās svītras. No turienes primārās dzimumšūnas migrē uz aizmugurējās zarnas endodermas ventrālo daļu un pēc tam aktīvi pārvietojas pa mezentēriju, migrācijas beigās aizpildot dzimumorgānu izciļņus. Migrācijas laikā, kā arī pirmajās 2-3 dienās pēc lokalizācijas gonādu rudimentā, primārās dzimumšūnas aktīvi vairojas un iziet astoņus replikācijas ciklus. Ja migrācijas sākumā ir aptuveni 50 primārās dzimumšūnas, tad divpadsmit attīstības dienu peļu embriju dzimumorgānu izciļņos primāro dzimumšūnu skaits pārsniedz 25 000.

ESŠ un pirmatnējo dzimumšūnu funkcionālo līdzību apliecina pēdējo pilnīga integrācija blastocistā ar iekšējās šūnu masas aizstāšanu un sekojošu embrija pilnvērtīgu attīstību, kura audi sastāv tikai no pirmatnējo dzimumšūnu pēctečiem. Arī citās īpašībās peļu pirmatnējās dzimumšūnas izrādījās identiskas ESŠ, demonstrējot spēju diferencēties dažādos virzienos, veidot embriju ķermeņus in vitro un veidot teratomas in vivo, ievadot subkutāni imūndeficīta pelēm, kas atgādina spontānas sēklinieku teratomas 129/ter pelēm.

Tika konstatēts, ka, pievienojot barotnei LIF, membrānai piesaistītu un šķīstošu SIF, izolētas 8 dienas vecu peļu embriju primārās dzimumšūnas izdzīvo un vairojas kultūrā 4 dienas, bet pēc tam iet bojā. Turklāt periods, kad kultūrā novēro primāro dzimumšūnu bojāeju, sakrīt ar peļu embriju attīstības stadiju (12,5–13,5 dienas), kad sievišķās primārās dzimumšūnas nonāk mejozē dzimumdziedzeru rudimentos, un vīrišķajās primārajās dzimumšūnās tiek bloķēta mitotiska dalīšanās. Tomēr, ja barotnei pievieno ne tikai augšanas faktorus LIF un SIF, bet arī FGF2, primārās dzimumšūnas turpina vairoties, un subkultūrās veidojas šūnu kolonijas, kas spēj vairoties pat pēc augšanas faktoru (SIF un FGF) izņemšanas no barotnes. Šādas šūnas var ilgstoši kultivēt uz embrionālo fibroblastu substrāta, nepievienojot šķīstošo augšanas faktoru LIF. Tika ierosināts šīs stabilās šūnu līnijas, kas iegūtas no pirmatnējām dzimumšūnām, saukt par embrionālajām dzimumšūnām. Šis termins nepavisam nav veiksmīgs, jo, kultivējot EG šūnas, nav iespējams iegūt embrionālās dzimumšūnas, kas spēj veikt turpmākus oogenēzes vai spermatogenēzes posmus. Tas ir saistīts ar faktu, ka EG šūnu līnijas, lai gan tās rodas no pirmatnējām dzimumšūnām, bet kultūrā iegūstot embrionālo pluripotento cilmes šūnu īpašības, zaudē spēju saistīties ar dzimumšūnu līnijām. Citiem vārdiem sakot, pirmatnējās dzimumšūnas, kultivējot, zaudē gametu prekursoru īpašības un tiek pārveidotas par ESC līdzīgām pluripotentām šūnām.

Ir atzīmēts, ka teratomas nerodas, ja EG šūnas tiek ievadītas imūndeficīta pelēm. Tiek pieņemts, ka cilvēka EG šūnu spējas radīt teratomas zudums ir saistīts ar faktu, ka šīs līnijas netika izveidotas tieši no kultivētām primārajām dzimumšūnām, bet gan iegūtas no šūnām, kas izolētas no embriju ķermeņiem. Tāpēc ir iespējams, ka tās ir pluripotentu, bet jau iesaistītu šūnu pēcteči.

Jāatzīmē, ka pastāv būtiskas atšķirības starp EG šūnām un pirmatnējām dzimumšūnām. Pēdējās neļauj iegūt himēriskus peļu embrijus, kas norāda uz pirmatnējo dzimumšūnu nespēju integrēties iekšējā šūnu masā jeb trofektodermā. Pirmatnējo dzimumšūnu populācijas īpašības ir līdzīgākas vēlāku embriju somatisko šūnu līnijām, kuru ievadīšana blastocistā arī neizraisa himērisku embriju veidošanos.

EG šūnu agregācijas rezultātā iegūto embrioīdu ķermeņu kultivēšanas tehnikas modifikācija ļāva iegūt citu pluripotentu šūnu populāciju, ko sauc par "no embriju ķermeņiem iegūtajām šūnām" (EBD šūnām), izmantojot selekciju selektīvās barotnēs. EBD šūnu spēja ilgstoši vairoties kultūrā ļāva izveidot stabilas specializētu šūnu līnijas. Tika iegūti šūnu kloni, kas ekspresē plašu specializētu šūnu mRNS un olbaltumvielu marķieru klāstu. Šī pieeja galu galā pierādīja, ka cilvēka primārās dzimumšūnas ir pluripotentas un in vitro diferencējas dažādos šūnu tipos: neironos, neiroglijās, asinsvadu endotēlijā, hematopoētiskajās šūnās, muskuļu un endodermālajās šūnās.

Alternatīvi embrionālo cilmes šūnu avoti

Alternatīvs cilvēka ESC līniju avots var būt hibrīdšūnas. Heterogēnas konstrukcijas, kas iegūta, elektroporācijas ceļā saplūstot cilvēka augļa somatiskajām šūnām ar govs olšūnu, no kuras iepriekš izņemts prokodols, implantācija pseidogrūsnu govju dzemdē ļauj iegūt iekšējo šūnu masu no mākslīga embrija pirmsimplantācijas attīstības stadijās. Šim nolūkam pirmajā posmā no govs olšūnas ar transplantētu cilvēka šūnu kodolu iegūst blastocistu.

Otrajā posmā no blastocistas tiek izolēts embrioblasts, un no tā, izmantojot Tomsona metodi, tiek izolētas ESŠ. Jāatzīmē, ka labākie rezultāti ESŠ līniju izolēšanā, izmantojot šo metodi, tika iegūti, izmantojot folikulu šūnu vai primāro dzimumšūnu kodolus, kas cilvēka organismā paliek ziemas miega stāvoklī. Tas ir saistīts ar faktu, ka cilvēka šūnu kodoliem, kas transplantēti govs olšūnā, jābūt nesaīsinātām telomērām un ar augstu telomeāzes aktivitāti, kas palīdz izvairīties no priekšlaicīgas ESŠ klonu novecošanās, kas iegūti no hibrīdas olšūnas (Repin, 2001). Ir zināms, ka vissvarīgākie ESŠ intracelulārie marķierproteīni ir Oct3, Oct4, Tcf, Groucho, kas pieder pie tā sauktajiem hromatīna klusinātāja proteīniem. Klusinātāji nodrošina īpaši kompaktu heterohromatīna iepakojumu, kas novērš eihromatīna cilpu veidošanos. Hromatīna iepakojums, ko mediē šie proteīni, korelē ar ESŠ genoma totipotenci. Līdz šim ir noskaidrots, ka nobriedušas liellopu un cilvēka oocītes ir vienīgais specializēto šūnu veids, kas citoplazmā satur augstu klusinātāja proteīnu koncentrāciju. Pamatojoties uz to, tika izstrādāta metode hibrīdu ESC iegūšanai, pārnesot somatisko šūnu kodolus enukleētās liellopu oocītās. Sākotnējie in vitro pētījumi ir parādījuši, ka liellopu oocītu citoplazma atjauno cilvēka somatisko šūnu kodolu genoma totipotenci pēc 12–24 stundu kultivēšanas.

Īpaši interesanti ir dati par cilvēka embriju preimplantācijas attīstības īpatnībām, kas norāda uz totipotentu šūnu aizvietošanu ar pluripotentu šūnu populāciju vēlāk nekā pelēm. Šūnu transformāciju pētījums parādīja, ka trofoblastu šūnas rodas arī no cilvēka blastocistu iekšējās šūnu masas šūnām, papildus ESŠ, kas norāda uz to kopējo potenci.

Ir zināms, ka blastocistas stadijā rodas divas atšķirīgi nodalītas šūnu populācijas. Viena no tām veido blastocistas ārējo slāni - trofektodermu, kuras atvasinājumi ir trofoblastu šūnas un citi placentas embrionālie komponenti. Otrā šūnu populācija ir sagrupēta blīvā masā, kas saskaras ar trofektodermas iekšējo virsmu. Iekšējās šūnu masas šūnu populācijas atvasinājumi ir visi embrija orgānu audi un rudimenti. Vēlās blastocistas stadijā no iekšējās šūnu masas veidojas ekstraembrionālā endoderma un epiblasts (primārā ektoderma). Šajā gadījumā epiblastu šūnas saglabā pluripotenci, savukārt spēja diferencēt ekstraembrionālās endodermas šūnas ir ierobežota.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Cilvēka embrionālo cilmes šūnu iegūšana

Vēl nesen tika uzskatīts, ka ESŠ nav iespējams iegūt no trofoblastiem. Tomēr no blastocistas izolēta diploīdu trofektodermas cilmes šūnu līnija barotnē, kas satur FGF2 un heparīnu LIF vietā, vairojas un transformējas par cilmes šūnām. Ja FGF2 tiek izņemts no barotnes, trofektodermas šūnas pārstāj vairoties, tajās sākas hromosomu endoreduplikācija, un trofektodermas šūnu elementi pakāpeniski transformējas par milzu trofoblastu šūnām. Iespējams, LIF nestimulē trofektodermas šūnu proliferāciju tāpēc, ka FGF2 iedarbina atšķirīgu transsignalizācijas mehānismu, jo FGF2, saistoties ar plazmas receptoru (FGFR2), citoplazmā aktivizē MAP kināzes - ERK1 un ERK2. Līdz ar to, blastocistas šūnās, ieslēdzot vienu signālceļu (LIF - gpl30 - JAK kināze - STAT3), iekšējās šūnu masas šūnas tiek pārveidotas par pluripotentām ESŠ, un, aktivizējoties otrajam transmembrānas signāltransdukcijas mehānismam (FGF2 - FGFR2 - MAP kināze ERK1/ERK2), blastocistā veidojas trofektodermas cilmes šūnas. Signālceļa izvēle savukārt ir atkarīga no oct4 gēna aktivitātes. Šis gēns, kas pieder pie POU domēna, atrodas autosomas 17 t lokusā un tiek ekspresēts oogenēzes laikā, šķelšanās periodā, kā arī blastocistas iekšējās šūnu masas šūnās un primārajās dzimumšūnās. Oct4 gēna funkcionālā loma ir kodēt transkripcijas faktoru, kas nepieciešams pluripotentu šūnu rašanās, to diferenciācijas un dediferenciācijas procesam.

Oct4 gēna ekspresija ESŠ mainās atkarībā no šī transkripcijas faktora mijiedarbības ar kofaktoriem. Virzīta oct4 ekspresijas regulācija blastocistās parādīja, ka, samazinoties tā aktivitātei, puse šūnu veido trofektodermu, savukārt, palielinoties inducētajai oct4 ekspresijai, galvenokārt rodas ESŠ.

Eksperimentā ESŠ nevar pārnest līnijā totipotentu blastomēru kultivēšanas laikā šķelšanās stadijā, kā arī gastrulācijas stadijā un vēlākos embrionālās attīstības posmos. Peļu ESŠ parasti tiek izolētas 3,5–4,5 grūtniecības dienā, kas atbilst sestajai (vienslāņa blastocista) un septītajai (divslāņu blastocista - agrīnais olšūnas cilindrs) normālai embrioģenēzei. Acīmredzot tikai preimplantācijas periodā peļu embriji satur šūnu populācijas, kas spēj transformēties par ESŠ. Līdz ar to ESŠ līniju izolēšana ir iespējama tikai noteiktos embrioģenēzes posmos. Zigota un blastomēri, kas rodas šķelšanās laikā, ir totipotenti, ņemot vērā dzīvotspējīga embrija ar embrionālajām membrānām un placentu attīstības iespēju. Dzimumšūnu kopējās potences zudums sākas vēlīnā morulas stadijā, kad turpmāka blastomēru saistība ir atkarīga no to atrašanās vietas. Agrīnās morulas blastomēras saglabā totipotenci, jo eksperimentālas manipulācijas ar izmaiņām to lokalizācijā, piemēram, atrašanās vietas inversija, neliedz pilnvērtīga embrija attīstībai.

Ir konstatēts, ka ESŠ izolēšanas efektivitāti līnijā ietekmē blastocistu stāvoklis to eksplantācijas laikā. Blastocistu izmantošana pēc septiņu dienu diapauzes modelēšanas peļu reproduktīvajā traktā, kurām olnīcas tika izņemtas 3,5. grūtniecības dienā un kurām tika ievadīts progesterons, veicina veiksmīgāku embrionālo cilmes šūnu līniju izolēšanu. Tiek pieņemts, ka šādos apstākļos palielinās blastomēru skaits, kas veido iekšējo šūnu masu. Iespējams arī, ka šūnu cikls pagarinās un lielākā daļa blastomēru nonāk G0 fāzē.

Turklāt stabilu pluripotentu ESC līniju izveide ir atkarīga no embriju genotipa: ESC ir diezgan viegli izolēt no 129 peļu līnijas blastocistām, tās ir daudz grūtāk iegūt, izmantojot CS7BL/6 peles, un praktiski nav iespējams izolēt ESC līniju no CBA/Ca peļu blastocistām. Acīmredzot agrīnajiem embrijiem piemīt dažas ģenētiskas iezīmes, kas ietekmē pluripotentas ESC līnijas attīstību. Tomēr, kultivējot izolētus epiblastus, kā arī selektīvi atlasot diferencējošās šūnas, ESC līnijas tomēr tika izolētas no agrīniem CBA/Ca peļu embrijiem.

Pārbaudīta standarta metode ESC līniju iegūšanai no blastocistas ir sniegta laboratorijas rokasgrāmatās par eksperimentu tehniku ar agrīniem embrijiem. Eksperimentālas ESC līnijas var iegūt arī, kultivējot izolētu 4,5 dienas vecu peļu embriju epiblastu (primāro ektodermu), izmantojot diezgan sarežģītu mikroķirurģisku tehniku un modificētus kultivēšanas apstākļus. Šīs procedūras darbietilpība ir pamatota, jo ESC līniju veidošanās biežums šajā gadījumā izrādījās ievērojami lielāks nekā darbos ar blastocistas iekšējo šūnu masu.

Lai izolētu ESC līnijas, katru klonu pārnes mikroiedobē, audzē 40–60 šūnu kopumu un pēc tam atkal izkliedē. Šīs procedūras vairākkārtēja atkārtošana ļauj iegūt imortalizētu ESC līniju ar maksimālu normokariotipisku šūnu proliferācijas ātrumu, kas piestiprinātas pie plastmasas, kuras saglabā totipotenci un augstu telomerāzes aktivitāti pēc 50–100 pasāžām. ESC līniju uzturēšanas procesā vislielākās briesmas ir barotnes vai seruma piesārņojums ar baktēriju endotoksīniem – pat neliela endotoksīna koncentrācija barotnē izraisa nenobriedušu dzimumšūnu masveida nāvi. Rūpīgi uzraugot lineāro augšanu un savlaicīgi izkliedējot, ESC kultūrā spēj simetriski dalīties, kurā abas meitas šūnas saglabā pluripotentas un spēj veikt neierobežotu skaitu šūnu ciklu, saglabājot diploīdu kariotipu un kopējo potenci.

Tīras cilvēka ESŠ populācijas atlasi var veikt pēc to genoma transfekcijas ar rekombinantām DNS molekulām, kas satur gēnu, kurš kodē zaļā fluorescējošā proteīna (GFP) sintēzi. GFP ekspresija palielinās, ja ESŠ tiek audzētas apstākļos, kas atbalsta to proliferāciju, savukārt, sākoties diferenciācijai, šī gēna ekspresijas līmenis samazinās, kas ļauj atlasīt tīras, stabilas pluripotentas šūnu līnijas selektīvā vidē. Kultivējot ESŠ, kas izolētas, izmantojot GFP atlasi, koloniju veidošanās biežums daudzkārt palielinās, jo selekcijas kultūru apstākļos diferencēto šūnu spēcīgā antiproliferatīvā iedarbība tiek novērsta.

Cilvēka embrionālo cilmes šūnu translācija līnijā tiek veikta, izmantojot to izolēšanas metodi no preimplantācijas embrijiem (80–120 šūnu stadijā), kas paliek pēc apaugļošanas in vitro procedūras. Šim nolūkam mākslīgi iegūtie “liekie” embriji tiek mehāniski izkliedēti Delbeko-Īgla vidē. Pēc šūnu marķēšanas ar selektīvām monoklonālām antivielām ar fluorescējošu marķējumu embrioblastu šūnas tiek izolētas. Embrioblastus izkliedē atsevišķās šūnās, izmantojot dispāzes-kolagenāzes maisījumu. Disociētās šūnas tiek audzētas speciālā vidē (80% Delbeko vidē + 20% teļa fetālā seruma 500 μg/ml IL-6, LIF un SCF klātbūtnē) uz pirmo 3 pasāžu embriju fibroblastu barotnes monoslāņa. Šajā gadījumā cilmes un cilmes šūnu izdzīvošana un proliferācija tiek uzturēta, pateicoties IL-6, LIF un SCF iedarbībai. Šādā vidē ESŠ aug kā nepiesaistītu, sablīvētu šūnu suspensijas kloni, kas jāatdala ar mīkstu, atkārtotu pipetēšanu. Jauni kloni suspendētajā kultūrā parādās 5.–7. dienā. ESŠ maksimālais augšanas ātrums tiek sasniegts, atkārtoti atdalot klonus 10–15 šūnu stadijā. Pēc tam katru klonu pārnes uz mikroiedobīti un audzē līdz 40–50 šūnu agregātam. Procedūra tiek atkārtota daudzas reizes pasāžās, palielinot kultūras tilpumu līdz 5–10 miljonu šūnu blīvumam uz 6 cm trauka. Izmantojot šādu pasāžu, Thomson izolēja 10 nemirstīgus cilvēka ESŠ klonus, kas pēc 100 pasāžām saglabāja augstu telomerāzes aktivitāti, spēju enerģiski vairoties, minimālas fenotipiskās īpašības un kopējo potenci ar spēju diferencēties jebkurā no 350 specializētajām šūnu līnijām, kas iegūtas no ekto-, mezo- un endodermas. Cilvēka ESŠ diferenciācija sākās (mainot barotni, pievienojot serumu un eliminējot LIF) ar šūnu piesaistīšanos substrātam, kas norāda uz citoskeleta attīstību un adhēzijas receptoru ekspresiju. Svarīgi ir tas, ka ar neierobežotu proliferāciju cilvēka ESŠ saglabāja normālu kariotipu.

Otra cilvēka ESC līniju izolēšanas metode ir balstīta uz primāro dzimumšūnu izmantošanu. Eksperimentāli pētījumi ir parādījuši, ka E šūnu līnijas var iegūt no 12,5 dienas vecu peļu embriju dzimumorgānu krokām. Tomēr šajos gadījumos cilmes šūnu līniju veidošanās biežums bija ievērojami zemāks nekā eksperimentos ar agrākiem embrijiem. Tajā pašā laikā primārās dzimumšūnas no 13,5 gestācijas dienu vecu peļu embriju dzimumdziedzeriem vispār nespēj transformēties līnijās.

Pirmās stabilās pluripotento cilvēka EG šūnu līnijas tika iegūtas no primārajiem gonocītiem, kas izolēti no 5–9 nedēļas vecu embriju dzimumdziedzeriem. Izolētās šūnas tika kultivētas uz inaktivētu peļu embriju fibroblastu substrāta DMEM vidē ar augļa serumu, kas papildināts ar merkaptoetanolu, forskolīnu un rekombinantiem cilvēka augšanas faktoriem (FGF un LIF). Pēc 7–12 dienām kultūrā parādījās daudzšūnu kolonijas, kas pēc morfoloģiskajām pazīmēm un molekulārajiem marķieriem atbilda cilvēka EG šūnām. Pēc agregācijas šīs šūnas veidoja embrioīdus ķermeņus, kuru tālākai attīstībai parādījās specializētas šūnas, kas raksturīgas visu trīs dīgļa slāņu atvasinājumiem. 10–20 pasāžu laikā EG šūnu līnijas saglabāja normālu kariotipu un nezaudēja pluripotenci.

Ir arī pierādīts, ka LIF, membrānai piesaistīto un šķīstošo Steel faktoru un TGF-b kombinētā darbība maina pirmatnējo dzimumšūnu attīstības programmu. Tā vietā, lai pārtrauktu mitotisko dalīšanos un sāktu diferencēties ooģenēzes vai spermatoģenēzes virzienā, pirmatnējās dzimumšūnas turpina vairoties. Pēc vairākiem papildu mitotiskiem cikliem tās kļūst līdzīgas epiblastu šūnām un, zaudējot dzimumšūnu prekursoru īpašības, tiek pārveidotas par pluripotentām embrionālām cilmes EG šūnām.

Tādējādi 1998. gadā no cilvēka augļa autopsijas audu dzimumorgānu rudimenta pirmo reizi tika izolētas imortalizētas pirmatnējo dzimumšūnu līnijas. Cilvēka embrioģenēzē pirmatnējās dzimumšūnas parādās dzeltenuma maisiņā 3. attīstības nedēļā, un 4.-5. nedēļā šīs šūnas migrē uz dzimumšūnu zonu, kur tās veido snaudošas primāro gonocītu populācijas. Neaktīvā stāvoklī pirmatnējās dzimumšūnas embrijā tiek saglabātas līdz dzimšanai. Pirmatnējo dzimumšūnu līnijas tiek izolētas no 5-9 nedēļu vecu embriju augļa dzimumšūnu tuberkula, kura ekstrahētos audus ex tempore apstrādā ar IV-V tipa kolagenāžu, hialuronidāzes un DNāzes maisījumu, lai palielinātu šūnu kvantitatīvo un kvalitatīvo ražu. Augļa dzimumšūnu audos pirmatnējās dzimumšūnas ieskauj stromas (mezenhimālās) Sertoli šūnas. Sertoli šūnu funkcionālais mērķis ir producēt antiapoptotiskus faktorus (Fas ligandu), mitogēnus un imūnsupresantus, kas aizsargā dzimumšūnas no organisma imūnsistēmas uzbrukuma. Turklāt dzimumšūnu nobriešanā svarīga loma ir dzimumšūnu stromas mikrovidei. Izolētās primārās dzimumšūnas tiek stādītas kultūrā virs barotājstromas slāņa, kas sastāv no pirmo trīs pasāžu augļa fibroblastiem. Visefektīvākā mitogēnu kombinācija ir komplekss, kas sastāv no LIF, FGF un forskolīna (cAMP veidošanās stimulatora). Primāro dzimumšūnu proliferācijai in vitro nepieciešams pievienot augļa serumu, kura klātbūtnē primāro gonocītu reprodukciju kultūrā pavada sfērisku šūnu klonu veidošanās, kas nav piesaistīti substrātam.

ASV Nacionālajos veselības institūtos, pamatojoties uz esošo datu apkopojumu par cilvēka ESC līniju izolēšanas metodēm no blastocistas, tika izdarīts provizorisks secinājums, ka veiksmīga ESC izolēšana, visticamāk, ir iespējama, kultivējot blastocistas ar labi izveidotu iekšējo šūnu masu (Cilmes šūnas: zinātnes progress un nākotnes pētījumu virzieni. Nat. Inst, of Health USA). No šī viedokļa optimālais ESC avots līniju veidošanai ir cilvēka blastocistas 5. attīstības dienā, no kurām, izolējot iekšējo šūnu masu, uzmanīgi jānoņem trofektoderma. Izolētā iekšējā šūnu masa, kas šajā posmā sastāv no 30–35 šūnām, jākultivē uz embrionālu peļu fibroblastu substrāta, kas ir izšķirošs nosacījums ESC koloniju veidošanai kultūrā.

Embrionālo cilmes šūnu fenotipisko īpašību analīze

Īpaši interesanta ir ESŠ fenotipisko iezīmju starpsugu salīdzinošā analīze. Tika konstatēts, ka cilvēka ESŠ kolonijas ir blīvi saplacinātu, epitēlijam līdzīgu šūnu kopumi, savukārt peļu embriju ķermeņi sastāv no vaļīga noapaļotu šūnu konglomerāta. Cilvēka ESŠ kodola un plazmas attiecības indekss ir zemāks nekā peļu ESŠ. Pērtiķu embrionālās cilmes šūnas veido plakanākas šūnu kolonijas ar nelīdzenām malām. Atsevišķas šūnas ir viegli saskatāmas primātu ESŠ agrīnajos klonos. Visu pētīto dzīvnieku sugu proliferējošās ESŠ neizpauž MHC I un II klases molekulas. Tajā pašā laikā cilvēka ESŠ pozitīvi reaģē uz TERA 1-60 un GCTM-2 antivielām, kas norāda uz keratīna/hondroitīna sulfāta proteoglikānu klātbūtni uz to virsmas, kas raksturīgi embrija-(terato)karcinomas cilmes šūnām. Oct4 gēna ekspresija visu dzīvnieku sugu ESŠ liecina, ka, neskatoties uz fenotipiskajām atšķirībām, cilvēka un peļu ESŠ acīmredzot ir aktivizēts viens un tas pats gēnu kopums, kas atbild par pluripotences saglabāšanu (Peru, 2001). Turklāt no žurku, cūku, trušu, primātu un liellopu embrijiem izolētām ESC līnijām ir līdzīgas morfoloģiskās īpašības, līdzīgs molekulāro identifikācijas marķieru kopums un gandrīz identisks molekulārais mehānisms embriogenēzes programmu īstenošanai, kas ļauj mums no jauna paskatīties uz ksenotransplantācijas problēmu.

Atšķirībā no normālas embrioģenēzes in vivo, ESŠ proliferācija in vitro nenotiek kopā ar dīgļslāņu veidošanos un notiek uz homeotisko Hoxgēnu bloķēšanas fona, t.i., bez organoģenēzes. Tā kā segmentācijas gēni nefunkcionē, ESŠ kultūrā nav iespējams reproducēt tādus embrioģenēzes periodus kā somītu dēšana, embrija segmentācija, dzeltenuma maisiņa, alantoisa un citu pagaidu orgānu un audu veidošanās. Kultivētās ESŠ, šķiet, ir sasalušas specializētu šūnu 350 restrikcijas līniju veidošanās procesa sākumā. Tādējādi meitas cilmes šūnu klons un centrāli lokalizēta ESŠ ir tikai embrija modelis, kura attīstības laikā dažādos audu reģionos vienlaikus veidojas dažādas specializētu šūnu līnijas, kas tomēr rodas no kopīgiem prekursoriem. Neskatoties uz minimālo receptoru līmeni uz ESŠ virsmas, tās saglabā spēju veikt primitīvus morfoģenētiskus procesus, imitējot agrīna embrija tilpuma struktūras: ESŠ suspensija kultūras agregātos veido struktūras, kas atgādina blastocistas vai pat vēlākus embrijus (olu cilindrus). Šādus suspensijas agregātus attiecīgi sauc par vienkāršiem un sarežģītiem embriju ķermeņiem.

Jauktajā diferenciācijā ektodermas (oct3, fgf-5, nodal), endodermas (gata-4), mezodermas (brahiūrija), kardiogēnās mezodermas (pkh-2.5), neirālās caurulītes (msx3) un hematopoēzes (elkf) agrīnie gēni vienlaikus tiek ekspresēti dažādās viena embrija ķermeņa šūnās. Izmantojot dažādas augšanas faktoru un citokīnu kombinācijas mērķtiecīgai iedarbībai uz dīgļslāņa šūnu veidošanos in vitro, vairākos gadījumos bija iespējams iegūt embrija ķermeņus, kuros priekšroku dod ektodermas vai mezodermas gēniem, kas paver ceļu gastrulācijas un organoģenēzes sākotnējo fāžu modelēšanai.

ESŠ klonālā augšana liecina par asimetrisku šūnu dalīšanos, kurā tikai viena ESŠ klona centrā saglabā neierobežotu proliferācijas potenciālu, savukārt otrā meitas šūna ģenerē cilmes šūnu paaudzi, kas jau piedzīvo diferenciāciju. Tāpēc klona proliferācijas ātrums embrija ķermeņa perifērijā ir augstāks nekā centrā. Augošā klona marginālās šūnas piedzīvo spontānu, nesakārtotu diferenciāciju, migrē vai iet bojā apoptotisku mehānismu ietekmē. Šie notikumi nosaka klona likteni: ja proliferācijas ātrums pārsniedz migrācijas un apoptotiskās šūnu nāves ātrumu, klons turpina palielināties, stabilizācija notiek, kad apoptozes ātrums un jaunu šūnu veidošanās ātrums ir vienāds, un regresija notiek, kad šo procesu attiecība ir apgriezta. Progenitoršūnas dalās simetriski, t.i., abas meitas šūnas pēc tam diferencējas nobriedušās specializētās šūnu līnijās. ESŠ un cilmes šūnu attiecība mainās, bet ESŠ skaits vienmēr ir tikai daļa no procenta no cilmes šūnu populācijas. Tāpēc tikai rūpīga pipetēšana un savlaicīga klonu dezagregācija var palielināt ESŠ skaitu kultūrā. Klonu dezagregācija 10–12 šūnu stadijā izrādījās visefektīvākā, lai iegūtu maksimālu ESŠ ražu. Šūnu diferenciācijas virziens un pakāpe embrioīdā ķermenī ir atkarīga no to atrašanās vietas. Embrioīdā ķermeņa ārējās šūnas neekspresē oct4 gēnu un diferencējas primārās endodermas šūnās, no kurām vēlāk veidojas parietālās un viscerālās ekstraembrionālās endodermas epitēlija veida šūnas. Embrioīdā ķermeņa iekšējās šūnas ekspresē oct4 gēnu un saglabā pluripotenci 48 stundu kultivēšanas laikā. Tomēr pēc tam kultūra morfoloģiski pārstrukturējas epitēlija monoslānī un sākas primārās ektodermas attīstību kontrolējošo gēnu ekspresija. Pēc tam sākas pilnīgas nesakārtotas citodiferenciācijas process, parādoties dažādiem šūnu tipiem, kas ir visu trīs dīgļa slāņu atvasinājumi. Embrioīdā ķermeņa šūnu spontānas diferenciācijas procesā vispirms parādās agregāti ar endodermas marķieriem dzeltenuma maisiņa fragmentu (cistu) veidā. Pēc tam šajās struktūrās parādās augošo kapilāru angioblasti un endotēlija šūnas. Spontānas diferenciācijas beigu stadijās no embrija ķermeņa iekšējām šūnām attīstās dažādas termināli diferencētas šūnas, tostarp neironi, glijas elementi, kardiomiocīti, makrofāgi un eritrocītu šūnas. Zināmā mērā (ņemot vērā germinālo audu slāņu veidošanās telpisko inversiju), izmantojot embrija ķermeņus, ir iespējams pētīt morfoģenētiskos procesus in vitro un analizēt embrionālās citodiferenciācijas sākotnējo periodu molekulāros mehānismus,kā arī lai noteiktu specifisku gēnu lomu šo procesu īstenošanā.

Tādējādi klona ietvaros ir šūnas, kurās ir atklātas dažādas ģenētiskās attīstības programmas - ESŠ, agrīnie priekšteči un diferencējošas priekšteču populācijas. ESŠ kultivēšana ar karājošā piliena vai masu kultūras metodēm bez barotnes slāņa un bez LIF pievienošanas barotnei neizbēgami noved pie embriju ķermeņu veidošanās. Embriju ķermeņu ārējā un iekšējā slāņa šūnu morfoloģija atšķiras. Ārējais slānis sastāv no lielām, sazarotām šūnām. To virsma, kas vērsta pret vidi, ir pārklāta ar daudzām mikrobārkstiņām. Šūnu ārējo slāni no iekšējā slāņa atdala bazālā membrāna, kas atgādina Reiherta membrānu, savukārt embriju ķermeņu iekšējā slāņa šūnas ir kolonnveida epitēlijs. Morfoloģiski iekšējais slānis, lai gan tajā ir daudz dalošu šūnu, vairāk atgādina nediferencētas ESŠ kolonijas.

Cilvēka embrionālo cilmes šūnu raksturojums

Parenhimatozi-mezenhimālās signalizācijas mijiedarbības neesamība uz homeozes gēnu bloķēšanas fona noved pie ESŠ traucētas augšanas kultūrā, jo tas traucē pagaidu orgānu infrastruktūras veidošanos un attīstību. ESŠ neorganizēta augšana un traucēta spontāna diferenciācija kultūrā ir saistīta ar nākotnes orgānu stromas karkasa mezenhimālā marķējuma neesamību: in vitro ir pilnīgi iespējams veidot miljoniem hepatocītu, bet nav iespējams iegūt vienu aknu daivu, kas ietvertu tādus strukturālus un funkcionālus elementus kā deguna blakusdobumus, Disse telpas un Kupffera šūnas.

Tiek uzskatīts, ka ESŠ pluripotence tiek realizēta tikai embrioģenēzē, veidojoties embrija audiem un orgāniem, savukārt placenta un nabassaite ir trofoblastu atvasinājumi. Trofektodermālajā membrānā ietvertās ESŠ secīgi ģenerē pagaidu šūnu klonus, kas īsteno attīstības programmu, izmantojot Nohtejova tilpuma topogrāfiskās matricas kombinatorisko mRNS, kas iepriekš nosaka pagaidu un galīgo orgānu šūnu telpisko izvietojumu, formu un izmēru, skaitu, kā arī parenhīmas montāžu strukturālās un funkcionālās vienībās. Tajā pašā laikā ESŠ joprojām ir vienīgais šūnu veids, kurā to potenciālu īstenošanas molekulārais mehānisms ir pilnībā atvienots no ģenētiskās attīstības programmas, un pašām ESŠ ir liegta spēja mijiedarboties ar citām šūnām gan receptoru uztveres, gan transsignalizācijas sistēmu bloķēšanas dēļ. Tomēr atbilstoša ESŠ aktivizēšana noved pie pakāpeniskas embrioģenēzes programmas attīstības, beidzoties ar pilnībā izveidota organisma, kas sastāv no miljardiem šūnu, piedzimšanu, kas ir gatavs ārpusdzemdes dzīvei. Šajā īstermiņa, bet neiedomājami ilgajā ceļā šūnu telpā neizbēgami rodas kļūdas gan molekulārajos mehānismos, kas nodrošina šūnu dzīvības aktivitāti, gan programmās, kas kontrolē to proliferāciju, diferenciāciju un specializāciju. Tāpēc mūsdienu farmakogenomikā molekulārās struktūras slimības un šūnu programmēšanas slimības tiek aplūkotas atsevišķi. Turklāt vairuma jauno zāļu darbība ir vērsta uz diferenciācijas, proliferācijas un organoģenēzes programmu korekciju, kā arī orgānu un audu reģenerāciju. Pieauguša cilvēka organismā ESŠ ļauj kontrolēt cilmes/priekšteču šūnu, kas transplantētas smadzenēs, aknās, liesā, kaulu smadzenēs un citos cilvēka orgānos, uzvedību, lai atjaunotu recipienta orgānu bojāto parenhīmu, diferencējot un specializējot donora šūnas uz saglabātās mezenhimālās matricas. Būtībā totipotences programma sāk realizēties olšūnas, zigotas un blastomēru genomu līmenī; tomēr šīs šūnas vēl nav klonētas un pasāžas tādā daudzumā, kas nepieciešams eksperimentālās un praktiskās medicīnas vajadzībām. Tāpēc ESC joprojām ir unikāls ģenētiskās informācijas avots, kas satur kodus embrija trīsdimensiju kartei un kodus specializētu šūnu līniju lineārai ierobežošanai gastrulācijas laikā.

ESŠ praktiski neierobežotais reģeneratīvais potenciāls ir saistīts ar faktu, ka to genoms, atšķirībā no diferencētu somatisko šūnu ģenētiskā aparāta, saglabā pluripotenci. Viena no ESŠ iestrādātās ģenētiskās informācijas snaudošā stāvokļa izpausmēm ir tā sauktais minimālais fenotips - uz ESŠ virsmas tiek ekspresēts ierobežots skaits receptoru, un attiecīgi šūnas kodola aparāta mijiedarbībai ar tās mikrovidi tiek izmantotas ļoti maz transsignalizācijas programmu. Uz specializēto šūnu līniju ierobežošanas un šūnu diferenciācijas gēnu hibernācijas fona tiek aktivizēti tikai aptuveni 30 no 500 gēniem, kuru produkti nodrošina šūnas saikni ar apkārtējo mikrovidi. Izmantojot gēnu ekspresijas sērijveida analīzes metodi, tika pierādīts, ka, kopīgi darbojoties genoma galvenajām funkcionālajām kastēm, kas regulē enerģētiku un metabolismu somatiskajās šūnās un ESŠ, pēdējām ir ļoti zems receptoru, G proteīnu, sekundāro kurjeru, transkriptāžu, ekspresijas un represijas kofaktoru mRNS līmenis, t.i., visa regulējošā signāla transmembrānas pārraides sistēma uz šūnu. Tas ir saistīts ar transsignalizējošo gēnu neesamību vai ļoti zemu ekspresiju. ESC genoma inducētās diferenciācijas periodā 18 funkcionējoši gēni sinhroni pārstāj darboties uz 61 transsignalizējošā gēna aktivācijas fona, kas kontrolē šūnu adhēzijas receptoru, ārpusšūnu matrices komponentu, restrikcijas transkriptāžu un signāla pārvades sistēmas kurjera elementu sintēzi uz kodola aparātu no šūnas plazmas membrānas receptoriem. Vienlaikus tiek bloķēta to gēnu ekspresija, kas ir atbildīgi par klusinātāju proteīnu sintēzi, kā arī gēnu ekspresijas koinhibitori, kas nodrošina ESC genoma totipotenci.

Gēnu marķieri ir atrasti visu trīs dīgļslāņu šūnām. Ektodermālā šūnu slāņa identifikāciju veic pēc nodal, oct3 un fgf-5 gēnu ekspresijas, mezodermas šūnas - pēc brahiūrijas, zeta-globīna gēnu ekspresijas, endoderma - pēc gata-4 gēna ekspresijas. Normālas embriogenēzes laikā gastrulācijas periodā tiek novērota aktīva nenobriedušu cilmes un cilmes šūnu populāciju migrācija, lokāli iezīmējot galvaskausa sejas kaulu, dažu smadzeņu daļu, perifērās nervu sistēmas, sirds vadīšanas sistēmas un aizkrūtes dziedzera attīstības zonas, kuru audi veidojas no migrējošo šūnu kloniem. Šūnu iezīmēšana pēc dīgļslāņu agrīnajiem gēniem atvieglo prekursoru šūnu migrācijas procesu topogrāfisko analīzi attīstošajā embrijā. Konkrēti, ir konstatēts, ka P19 embrija karcinomas šūnu agregātos pirmās mezodermas gēna brahiūrijas ekspresija sākas audu plazminogēna aktivatora, α-fetoproteīna, keratīna 8 un keratīna 19 gēnu, kas ir pirmās migrējošās mezodermas populācijas marķieri, samazinātas ekspresijas periodā. Līdz ar to mezodermas izcelsmes audu veidošanās sākas tikai pēc punktveida migrācijas procesa pabeigšanas un mezodermas cilmes šūnu izkliedes.

Neskatoties uz ārkārtīgi ierobežotajām fenotipiskajām iezīmēm un vairuma transsignalizācijas vienību neesamību, ESC joprojām ekspresē dažas receptoru molekulas, kuras var izmantot to identificēšanai. Jāatzīmē, ka ESC marķieru antigēni cilvēkiem un primātiem izrādījās izplatīti. Visbiežāk ESC marķēšanai tiek izmantotas marķētas antivielas pret membrānai piesaistītiem antigēniem SSEA-3, SSEA-4 (unikāli lipīdu antigēni, kas pārstāv glikolipīda GL7 kompleksu ar siālskābi), kā arī augsta polimēra glikoproteīniem TRA-1-81, TRA-1-60. Turklāt ESC ekspresē specifisko embrionālo antigēnu SSEA-1 un endogēno sārmaino fosfatāzi, kā arī specifisko transkripcijas faktoru Oct4. Pēdējais ir nepieciešams ESC proliferācijas mehānismu uzturēšanai - specifiskais transkripcijas faktors Oct4 aktivizē fibroblastu augšanas faktora 4 gēna ekspresiju un stabilizē gēnu kastes ekspresiju, kas ir atbildīga par neierobežotu DNS replikāciju nenobriedušās šūnās. Svarīgākie intracelulārie marķieru proteīni ir Oct3, Oct4, Tcf un Groucho, kas ir saistīti ar hromatīna klusinātāja proteīniem.

Gandrīz tūlīt pēc daudzu gadu veiksmīgiem mēģinājumiem kultivēt ESŠ ārpus ķermeņa un iegūtām pirmajām no peļu blastocistas izolēto cilmes šūnu kultūrām un primāro dzimumšūnu kultūrām, sākās ESŠ pluripotentā potenciāla izpētes posms, kad tās tika ievadītas embrijos agrīnās attīstības stadijās. Tika pierādīts, ka morulas un blastocistas stadijās ESŠ spēj veidot himēriskus embrijus, kuros donoru ESŠ pēcnācēji ir atrodami visos somatiskajos audos un pat gametās. Tādējādi attīstības bioloģijā, izmantojot ESŠ, tika izveidots "tilts" starp eksperimentāliem pētījumiem in vivo un in vitro, kas ievērojami paplašināja iespējas pētīt primāro audu un orgānu veidošanās procesus, to diferenciāciju un embrionālo organoģenēzi.

Ir skaidri noteikts, ka in vivo embriogenēzes laikā ESŠ tiek integrētas agrīnā embrija šūnu masā, un to atvasinājumi ir atrodami visos orgānos un audos. ESŠ kolonizē dzimumšūnu līniju himēriskajā embrijā, kuras pēcteči veido pilnvērtīgas olšūnas un spermatozoīdus. Embrionālās cilmes šūnas ir klonogēnas – viena ESŠ spēj izveidot ģenētiski identisku šūnu koloniju ar molekulāriem marķieriem, kas ietver oct4 gēna un sārmainās fosfatāzes ekspresiju, augstu telomerāzes aktivitāti un noteiktu embrija antigēnu ekspresiju.

Lai pētītu embriogenēzes mehānismus, izmantojot ESŠ, ir izstrādāta morulas himerizācijas metode, izveidojot bioloģisku konstrukciju, kuras ārpusē atrodas recipienta tetraploīdo blastomēru slānis, bet iekšpusē tiek ievadītas donora ESŠ. Tādējādi trofoblasts veidojas no recipienta tetraploīdo blastomēru pēcnācējiem, kas nodrošina implantāciju un placentas piestiprināšanos, un donora ESŠ darbojas kā iekšēja šūnu masa, no kuras veidojas dzīvotspējīga embrija ķermenis un primāro cilmes šūnu līnija. ESŠ pētnieciskā vērtība slēpjas ne tikai tajā, ka in vitro manipulāciju laikā ar to genomu tiek saglabāta pluripotence, bet arī tajā, ka tiek saglabāta ESŠ spēja piedalīties himēriska embrija primāro dzimumšūnu veidošanā. Ir pierādīts, ka tikai vienas ģenētiski modificētas ESŠ pēcnācēji apdzīvo visus himēriska embrija primāros rudimentus un attīstības audus, kas iegūti, agregējot vai kokultivējot šo šūnu ar 8 šūnu embriju. Kad peļu morulā tika transplantētas ar zaļā fluorescējošā proteīna gēnu transfektētas ESŠ, šīs šūnas fluorescējoši pēcnācēji tika atrasti visos pētītajos embrija audos (Shimada, 1999). ESŠ transplantācija morulā ļauj izveidot dzīvotspējīgas peles, kuru organisms sastāv tikai no donora ESŠ pēcnācējiem, kas paver perspektīvas dažādām terapeitiskās klonēšanas iespējām. Šī metodoloģiskā pieeja tagad tiek veiksmīgi izmantota attīstības bioloģijas problēmu pētīšanā, jo īpaši, tā tiek izmantota, lai analizētu X hromosomas ģenētiskās inaktivācijas vai ESŠ epigenetiskās nestabilitātes mehānismus. ESŠ transplantācija agrīnā embrijā tiek izmantota arī lauksaimniecības biotehnoloģijā, kā arī gēnu terapijas eksperimentos.

Ģenētiski modificētu ESŠ transplantācija tiek izmantota, lai pārbaudītu mutantu gēnu mērķa šūnas. In vitro kultivētas ESŠ tiek izmantotas biotehnoloģijā, lai izveidotu izslēgšanas peles. Šim nolūkam pētāmo gēnu no ESŠ izņem ar homologas rekombinācijas (izslēgšanas) palīdzību, un šūnas, kurām trūkst šī gēna, tiek izolētas uz selektīvas barotnes. Izslēgšanas ESŠ pēc tam tiek ievadītas blastocistā vai agregētas ar morulas blastomērām. Šādā veidā iegūtie himēriskie agrīnie embriji tiek transplantēti recipientu mātītēm, un no jaundzimušo peļu vidus tiek atlasīti indivīdi ar gametām, kas nullizigotas attiecībā uz doto gēnu. Šī tehnoloģija ir izmantota, lai izveidotu daudzas izslēgšanas peļu līnijas, kuras plaši izmanto eksperimentālajā bioloģijā un eksperimentālajā medicīnā. Šādi bioloģiskie modeļi tiek izmantoti, lai pētītu noteiktu gēnu nozīmi embrionālajā attīstībā, kā arī to lomu cilvēku slimību un patoloģisko stāvokļu mehānismos. Turklāt izslēgšanas dzīvnieku līnijas tiek izmantotas jaunu gēnu terapijas metožu preklīniskajā testēšanā. Piemēram, transfektējot mutanta gēna normālo alēli ESŠ genomā, ir iespējams efektīvi koriģēt mutāciju, kas ietekmē hematopoētisko sistēmu. Svešu gēnu ievadīšana ESŠ ļauj ātri izveidot homozigotu transgēnu laboratorijas dzīvnieku līnijas. Tomēr jāatzīmē, ka mērķtiecīgas rekombinācijas gēnu dzēšanas tehnika līdz šim ir droši izstrādāta tikai saistībā ar peļu ESŠ. Izmantojot dubultās izslēgšanas peļu ESŠ, tika noteikta gēnu klastera reģiona 7. hromosomā (cilvēka 19. hromosomas genoma reģiona kopija) un 11. hromosomas proksimālā reģiona (cilvēka 5g hromosomas kopija) funkcionālā loma - šo gēnu dzēšana peļu ESŠ ļāva novērtēt to analogu funkciju cilvēkiem.

Cilvēka embrioģenēzes gēnu funkcijas izpētes iespējas ir paplašinājušās, kuru transfekcija laboratorijas dzīvnieku ESŠ genomā ir ļāvusi jo īpaši noskaidrot kriptogēna lomu kardiogēnās mezodermas, pax-6 gēna, veidošanā un attīstībā acu embrioģenēzē. Tiek apkopotas pirmās gēnu ekspresijas kartes nenobriedušās proliferējošās teratokarcinomas ESŠ un peļu blastocistās, un ir apstiprināta transsignalizējošo gēnu nomācoša represija ESŠ. 60-80 mutantu ESŠ un 20-30 normālu preimplantācijas peļu embriju šūnu kombinācija noved pie himērisku embriju attīstības, kuros orgānu aizmetņi sastāv no donora un recipienta šūnām, kas ļauj noskaidrot nezināmu gēnu lomu gastrulācijā un organoģenēzē. Attīstošo peļu embriju gēnu funkcionālā karte tika papildināta ar informāciju par sf-1 gēna lomu virsnieru un dzimumdziedzeru veidošanā, wt-1 gēna lomu nieru veidošanā, myoD saimes gēnu lomu skeleta muskuļu veidošanā un gata-1-4 saimes gēnu lomu eritropoēzes un limfopoēzes rudimentu restrikcijas nobriešanā.

Izmantojot vektoru rekombināzes, mērķtiecīga mātes un tēva gēnu alēļu izslēgšana ESŠ ļāva noskaidrot dažādu gēnu funkcijas agrīnā embriogenēzes periodā, un nezināmu cilvēka gēnu mērķtiecīgas pārneses tehnoloģija peļu ESŠ veicina jaunu mutantu gēnu atklāšanu, kas ir atbildīgi par smagas iedzimtas patoloģijas attīstību. Izmantojot izslēgšanas metodi, tika noteikta dažu gēnu obligātā nozīme embrionālo audu veidošanā: gata-4 - miokardam, gata-1 - hematopoētisko audu eritroīdajai līnijai, myoD - skeleta muskuļiem, brahiūrija - mezodermai, restrikcijas transkriptāzes hnf3 un hnf4 - aknu cilmes šūnām, rag-2 - T- un B-limfocītu klonu veidošanai (Repin, 2001). Gēnu dubultā dzēšana ESŠ ir pavērusi piekļuvi dīgļslāņa gēnu funkcionālās lomas, segmentācijas un homeozes pētījumiem, un ESŠ transplantācija ir ļāvusi iegūt dzīvotspējīgus starpsugu hibrīdus embrijus. Izmantojot uzlabotu metodi viena donora ESC transplantācijai 8 šūnu embrijā, ir pierādīts himerizācijas fakts daudzu recipienta embrija orgānu šūnu līmenī. Jāatzīmē, ka pēc cilvēka hematopoētisko cilmes šūnu ievadīšanas blastocistā recipienta peļu orgānos ir atrasti cilvēka audu šūnu asni. Ir noskaidrots, ka pluripotentās ESC cirkulē peļu embriju asinīs orgānu veidošanās periodā. Iespējams, ka to bioloģiskā funkcija slēpjas nākotnes imūnsistēmas embrionālajā organizācijā. Ar ESC palīdzību laboratorijas apstākļos ir reproducēti atbilstoši cilvēka ģenētiskās patoloģijas modeļi: distrofīna gēna dubultā izslēgšana modeļu Dišēna muskuļu distrofijai pelēm un atm gēna (hromatīna signālkināzes sintēzes kontroles) izslēgšana - ataksija-telangektāzija. Šīs letālās iedzimtās slimības bērniem gadījumā Purkinjē šūnu deģenerācija smadzenītēs attīstās DNS reparācijas defektu dēļ, ko pavada aizkrūtes dziedzera involūcija proliferējošo šūnu nāves dēļ. Ataksijas-telangektāzijas klīniskā aina, patofizioloģija un patomorfoloģija himēru pelēm, kas reproducēta, ievadot patoloģisko ģenētisko informāciju ESC, atbilst cilvēku rādītājiem. Papildus ataksijai-telangektāzijai, izmantojot ESC un knockout peles, ir izstrādāti dažu iedzimtu homozigotu cilvēku slimību eksperimentāli modeļi, kas saistīti ar ogļhidrātu un lipīdu metabolisma patoloģiju, aminoskābju katabolismu un vara un bilirubīna izdalīšanos, kas ir ievērojami paplašinājis eksperimentālās medicīnas iespējas jaunu metožu preklīniskās testēšanas posmā atbilstošo cilvēku slimību ārstēšanai.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]

Cilmes šūnu citohibrīdu izmantošana

Hibrīdšūnas, kas iegūtas, sapludinot ESŠ ar somatiskajām šūnām, ir atbilstošs un daudzsološs modelis cilmes šūnu pluripotences pētīšanai un diferencētu šūnu hromosomu pārprogrammēšanai. Citohibrīdi, kas iegūti, sapludinot ESŠ ar pieauguša dzīvnieka diferencētām šūnām, ļauj pētīt dažādu "vecumu" genomu attiecības: unikāla situācija rodas, ja homologas hromosomas, kas cēlušās no šūnām dažādās diferenciācijas stadijās un dažādās brieduma pakāpēs, atrodas vienā kodolā, kur tās var viegli apmainīties ar transaktīviem regulatoriem signāliem. Ir grūti paredzēt, kā homologu hromosomu cisregulatorās epigenetiskās sistēmas, kas veidojas individuālās attīstības laikā, reaģēs uz transaktīvo signālu ietekmi, kas rodas no embrionāli radniecīgiem genomiem. Turklāt hibrīdšūnās notiek vecāku hromosomu segregācija, kas ļauj pētīt genomu mijiedarbību atsevišķu hromosomu līmenī, tas ir, potenciāli identificēt specifisku hromosomu līdzdalību pluripotences saglabāšanā vai, gluži pretēji, izejā uz diferenciāciju.

Kā pirmais eksperimentālais modelis genomu ar atšķirīgu "attīstības vēsturi" mijiedarbības pētīšanai tika izmantoti citohibrīdi, kas iegūti, sapludinot pluripotentas teratokarcinomas un diferencētas somatiskās šūnas. Dažos gadījumos šādas hibrīdšūnas saglabāja pluripotentās īpašības diezgan augstā līmenī. Jo īpaši teratokarcinomas-somatisko hibrīdu šūnas inducēja īstu teratomu attīstību, kas saturēja visu trīs dīgļa slāņu atvasinājumus, un in vitro suspensijas kultūrās tās veidoja embriju ķermeņus. Pat šāda veida starpsugu citohibrīdos embriju antigēnu klātbūtne tika konstatēta gadījumos, kad somatiskie partneri saplūšanā ar teratokarcinomas šūnām bija limfocīti vai timocīti. Jāatzīmē, ka citohibrīdi, kas izveidoti, sapludinot teratokarcinomas šūnas ar fibroblastiem, fenotipā atbilda fibroblastiem.

Vissvarīgākais konstatētais fakts ir tas, ka teratokarcinomas-somatisko šūnu hibrīdšūnās parādījās diferencētās šūnas genoma pārprogrammēšanas pazīmes, ko raksturoja vai nu atsevišķu gēnu, vai somatiskā partnera neaktīvās X hromosomas reaktivācija. Tādējādi teratokarcinomas-somatisko šūnu tipa citohibrīdu pētījumu rezultāti liecina, ka hibrīdšūnās bieži tiek saglabāta pluripotence un ir novērojamas somatiskā partnera genoma pārprogrammēšanas pazīmes.

Eksperimentos par intraspecifisku embriju hibrīdšūnu iegūšanu, sapludinot peļu ESC ar pieaugušo splenocītiem, tika pētītas šādu citohibrīdu īpašības, analizēta vecāku hromosomu segregācija un novērtēta hibrīda genoma pluripotence. Intraspecifiskām hibrīdšūnām, kas iegūtas, sapludinot teratokarcinomas šūnas ar somatiskajām šūnām, parasti raksturīgs zems hromosomu segregācijas līmenis ar tetraploīdu vai gandrīz tetraploīdu kariotipu. Līdzīgs hromosomu sastāvs tika novērots citohibrīdos primāro dzimumšūnu sapludināšanas laikā ar limfocītiem. Tajā pašā laikā starpsugu hibrīdšūnas, kas iegūtas, sapludinot peļu teratokarcinomas šūnas ar ūdeļu limfocītiem, uzrādīja intensīvu somatiskā partnera hromosomu segregāciju.

Kvalitatīvi jauns posms vecāku hromosomu segregācijas pētījumā intraspecifiskos hibrīdos sākās pēc tam, kad tika izstrādāta metode mikrosatelītu analīzei, izmantojot polimerāzes ķēdes reakciju, pateicoties kurai katrai peles hromosomai tika atrasti vairāki simti marķieru, kas ļāva droši atšķirt jebkuru homologu hromosomu pāri hibrīdšūnās.

Apvienojot ESŠ (HM-1 šūnas ar hipoksantīna fosforiboziltransferāzes aktivitātes deficītu, 2n = 40, XY, izolētas no 129/01a peļu blastocistām) ar kongēnu DD/c peļu splenocītiem, bija iespējams iegūt hibrīdu klonu komplektu, kas morfoloģiski bija līdzīgs ESŠ. Visi kloni tika izolēti selektīvā vidē, kurā var augt tikai šūnas ar aktīvu hipoksantīna fosforiboziltransferāzi. Elektroforētiskā analīze parādīja, ka visiem kloniem bija hipoksantīna fosforiboziltransferāzes alēlisks variants, kas raksturīgs DD/c pelēm. Citoģenētiskā analīze parādīja, ka trim no četriem hibrīdajiem kloniem bija gandrīz diploīds hromosomu komplekts. Vienā gandrīz tetraploīdā klonā bija divas hibrīdu šūnu populācijas, no kurām viena bija tetraploīda, bet otrā, mazākā, bija diploīda.

Mikrosatelītu analīze, kas ļauj atšķirt jebkuru homologu hromosomu pāri pelēm 129/01a un DD/c, hibrīdklonos ar gandrīz diploīdu komplektu parādīja, ka divos klonos bija skaidra somatiskā partnera autosomu preferenciāla eliminācija. Lielākajai daļai autosomu klonos HESS2 un HESS3 bija 129/01a līnijas, t.i., pluripotentā partnera, marķieri. Izņēmums bija 1. un I hromosoma: klonos HESS2 un HESS3 līdzās HM-1 šūnu marķieriem nelielā daudzumā bija arī somatiskā partnera marķieri. Šādi rezultāti var atspoguļot nepilnīgu somatiskā partnera 1. un I hromosomas segregāciju un atbilst citoģenētiskajiem datiem, ka šo hromosomu trisomija ir novērota 30–40% klonu HESS2 un HESS3 šūnās. Klons HESS4 būtiski atšķīrās pēc hromosomu sastāva: daudzas šī klona autosomas cēlušās no ESC genoma (2., 3., 4., 5., 6., 7., 10., 13., 14. un 17. hromosoma), bet 1., 9., 11., 12., 15., 16., 18. un 19. hromosomu pārstāvēja abu vecāku homologi. Šo homologo hromosomu iezīmējošo mikrosatelītu kvantitatīvā attiecība bija aptuveni 1:1. Tas ļāva autoriem pieņemt, ka viens homologs cēlies no ESC genoma, bet otrs - no diferencētām šūnām. Dažos klona HESS4 subklonos bija sastopami tikai somatiskā partnera 18. un 19. hromosomas marķieri. Iegūtie rezultāti liecina, ka HESS4 klona šūnās papildus somatiskā partnera hromosomu segregācijai notika arī viena vai abu iepriekš minēto pluripotentā genoma hromosomu homologu eliminācija, tas ir, notika abu vecāku hromosomu divpusēja segregācija - ļoti neparasta parādība, jo tikai viena no vecākiem hromosomu segregācija ir raksturīga citohibrīdiem.

Turklāt pēc 20. pasāžas visos hibrīdšūnu klonos bija tikai somatiskā partnera X hromosomas marķieri, t.i., klonos ESC X hromosoma bija aizstāta ar somatiskā partnera X hromosomu. Šo svarīgo faktu apstiprina in situ hibridizācijas dati, izmantojot FITC iezīmētu zondi, kas ir specifiska peles X hromosomai: pozitīvs signāls tika konstatēts tikai vienā hromosomā. Jāatzīmē, ka agrākajos kultivēšanas posmos (pirms 15. pasāžas) saskaņā ar citoģenētiskajiem datiem daudzām šūnām bija divas X hromosomas. Tādēļ selektīvu barotņu izmantošana ļauj manipulēt ar hibrīdšūnu hromosomu sastāvu un selektīvi atlasīt klonus, kas nes tikai vienas somatiskā partnera hromosomas uz ESC genoma fona.

Tā kā citohibrīda genoma unikāla iezīme ir vecāku genomu lokalizācija vienā kodolā, dabiski rodas jautājums par embrija genoma pluripotento īpašību saglabāšanos ESC-somatisko šūnu hibrīdos tā ciešā kontaktā ar diferencētas šūnas genomu. Morfoloģiski ESC un somatisko šūnu citohibrīdi bija līdzīgi vecāku ESC līnijai. Pluripotences novērtējums parādīja, ka visi kloni ar gandrīz diploīdu hromosomu komplektu spēja veidot embrioīdus ķermeņus suspensijas kultūrās, kurās bija klāt trīs dīgļa slāņu atvasinājumi.

Lielākajai daļai hibrīdšūnu bija ECMA-7 antigēns, agrīniem peļu embrijiem raksturīgs marķieris, un tām bija arī augsta sārmainās fosfatāzes aktivitāte. Vispārliecinošākie dati par hibrīdšūnu augstajām pluripotentajām īpašībām tika iegūti eksperimentos, iegūstot virkni injekcijas himēru, iesaistot HESS2 klona hibrīdšūnas. Bioķīmisko marķieru analīze parādīja, ka donoru hibrīdšūnu pēcteči bija sastopami lielākajā daļā himēru audu. Tādēļ hibrīdšūnas, kas iegūtas, sapludinot ESC un somatiski diferencētas šūnas, saglabā augstu pluripotenci, tostarp spēju veidot himēras, injicējot tās blastocistas dobumā.

Kloni HESS2 un HESS4 būtiski atšķīrās vecāku hromosomu sastāvā, taču tiem bija līdzīgas pluripotentās īpašības. Varētu pieņemt, ka pluripotence hibrīda genomā izpaužas kā dominējoša īpašība, taču ir iespējams, ka ne visas embrija genoma hromosomas ir iesaistītas pluripotences saglabāšanas procesā. Ja šis pieņēmums ir pareizs, tad var sagaidīt, ka dažu pluripotentā partnera hromosomu eliminācija no hibrīdšūnu genoma nebūs saistīta ar to pluripotentā statusa izmaiņām. Šajā gadījumā vecāku hromosomu segregācijas analīze embrija hibrīdšūnās ļautu mums tuvāk pievērsties to hromosomu identificēšanai, kas ir atbildīgas par embrija šūnu pluripotences kontroli.

O. Serovs un līdzautori (2001) neatrada nevienu pēcnācēju starp 50 pēcnācējiem, kas iegūti, krustojot himēras ar normālām pelēm, kurām bija 129/01a peles genotips un kuras nesa DD peļu X hromosomu. Autori uzskata, ka tas ir saistīts ar pluripotences samazināšanos hibrīdšūnās somatiskā genoma ietekmē. Alternatīvs skaidrojums varētu būt trisomijas negatīvā ietekme uz dažām autosomām un dzimumhromosomu nelīdzsvarotība (XXY tika novērotas šūnās līdz 15. pasāžai) hibrīdšūnās mejozes laikā. Ir zināms, ka XXY šūnas nespēj iziet mejozi un veidot gametas. Trisomija var izraisīt arī hibrīdšūnu proliferatīvās aktivitātes samazināšanos, kā rezultātā selektīvā priekšrocība himēru attīstībā var piederēt recipienta embrija šūnām. No tā izriet, ka, lai pienācīgi novērtētu hibrīdšūnu pluripotento potenciālu, ir nepieciešams iegūt hibrīdklonus ar normālu diploīdu hromosomu komplektu.

O. Serova un līdzautoru eksperimentos (2001) pirmo reizi tika pierādīta somatisko šūnu X hromosomas pārprogrammēšanas iespēja hibrīdšūnu genomā. Šis autoru secinājums izriet no hprt gēna (X hromosomas marķiera) ekspresijas analīzes himērās: visos analizētajos himēriskajos audos tika konstatēta DD/c peļu hprt alēliskā varianta klātbūtne. Ir lietderīgi uzsvērt, ka pēc hibrīdšūnu ievadīšanas blastocistas dobumā citohibrīdi nonāk neselektīvos apstākļos, un X hromosomas saglabāšanās hibrīdšūnu genomā nozīmē, ka tā ir kļuvusi par tās obligāto komponentu, un genoms to nediferencē no pluripotentā partnera Y hromosomas.

Apkopojot somatisko un pluripotento genomu mijiedarbības analīzes rezultātus hibrīdajās embrionālajās šūnās, autori secina, ka dažos citohibrīdos pluripotence izpaužas kā dominējoša īpašība. Hibrīda genoms spēj pārprogrammēt diferencētu šūnu atsevišķas hromosomas, kas tomēr neizslēdz somatiskā genoma apgrieztās ietekmes uz embrija genoma pluripotenci iespēju. Kultivējot hibrīdās šūnas, diferenciācijas indukcija notiek ievērojami biežāk nekā sākotnējā ESŠ HM-1 vecāku līnijā. Līdzīgs efekts tiek novērots primāro koloniju veidošanās laikā: daudzas embrija hibrīda šūnu primārās kolonijas diferencējas agrīnās veidošanās stadijās ar lieliem klonu zudumiem to atlases un reprodukcijas laikā.

Tādējādi citohibrīdi, kas radušies, ESŠ saplūstot ar somatiskajām šūnām, neskatoties uz ciešu kontaktu ar diferencētu šūnu genomu, saglabā pluripotenci kā unikālu embrionālā genoma īpašību. Turklāt šādās hibrīdšūnās ir iespējama atsevišķu hromosomu, kas rodas no diferencētām šūnām, pārprogrammēšana. Joprojām nav skaidrs, cik lielā mērā hibrīdšūnās tiek saglabātas embrija genoma pluripotentās īpašības, jo īpaši to spēja piedalīties dzimumšūnas veidošanā himērās. Tas prasa iegūt embrija hibrīdšūnas ar normālu kariotipu. Jebkurā gadījumā pluripotentas embrija hibrīdšūnas var kļūt par reālu ģenētisko modeli hromosomu identificēšanai, kas iesaistītas pluripotences uzturēšanā vai kontrolēšanā, jo vecāku hromosomu divpusēja segregācija potenciāli sniedz šādu iespēju.

Ne mazāk pievilcīgs ir pētījums par parādību, ko O. Serovs u.c. (2001) definē kā "hromosomu atmiņu". Hibrīda genomā homologās hromosomas atrodas divās alternatīvās konfigurācijās: somatiskā partnera homologi reiz ir diferencējušies, savukārt pluripotentā partnera homologos šis process tikai sākas. Līdz ar to hibrīdšūnu augsto pluripotento īpašību saglabāšana norāda, ka ESC homologu "pluripotentā" konfigurācija hibrīdgenomā ir pietiekami stabila, neskatoties uz somatiskā partnera radīto transakcionālo faktoru ietekmi. Iepriekš aprakstītās diferencētā genoma homologo hromosomu pārprogrammēšanas pazīmes himēru attīstības laikā neizslēdz iespēju, ka citohibrīdu veidošanās un kultivēšanas pirmajos posmos in vitro tie saglabā savu statusu, kas iegūts diferenciācijas laikā in vivo. Saskaņā ar nesen iegūtajiem datiem, pārnesot embrionālās hibrīdšūnas uz neselektīvu vidi, tās uzrāda intensīvu tikai somatiskā partnera hromosomu elimināciju, t.i., hibrīdšūnu genoms viegli atšķir homologus pēc 10-15 pasāžu in vitro kultivēšanas. Tādējādi embrionālās hibrīdšūnas ir daudzsološs eksperimentāls modelis ne tikai tādas embrionālā genoma fundamentālas īpašības kā pluripotences, bet arī tās alternatīvas - embrionālās diferenciācijas - izpētei.

Embrionālo cilmes šūnu transplantācijas terapeitiskā efektivitāte

Pirms ESŠ un to atvasinājumu transplantācijas terapeitiskās efektivitātes analīzes mēs apkopojam iepriekš minēto materiālu. ESŠ iespējas pilnībā īstenot embriogenēzi in vitro ir nepietiekamas, jo attīstības defekti šajā gadījumā rodas mezenhimālo cilmes šūnu trūkuma dēļ, kas organismā rodas autonomi un neatkarīgi no ESŠ. ESŠ ģenētiskais potenciāls ir mazāks nekā zigotas ģenētiskais potenciāls, tāpēc ESŠ netiek tieši izmantotas embriju klonēšanai. Gēnu funkciju pētījumos tiek izmantots ESŠ unikālais bioloģiskais potenciāls kā vienīgajām šūnām, kurās attīstības programmas tiek pilnībā ieviestas konsekventā ieviešanā. Ar ESŠ palīdzību tiek atšifrētas pirmās signālu kombinācijas, kas aktivizē agrīno un vēlīno gēnu ekspresiju, kas kodē trīs dīgļa slāņu attīstību. ESŠ genoma pluripotences saglabāšana in vitro padara tās par unikālu instrumentu reparatīvai reģenerācijai, kas spēj automātiski papildināt šūnu zudumus orgānu un audu bojājumu gadījumā. Ideālā hipotētiskā scenārijā var pieņemt, ka “... transplantējot donora ESC, recipienta organismā tiek pārnestas kompakti iepakotas programmas, kas labvēlīgos apstākļos tiek realizētas jaunu audu veidošanā”7, kas spēj “... efektīvi integrēties recipienta organismā gan morfoloģiskā, gan funkcionālā līmenī”.

Protams, pēc ESŠ monodiferenciācijas metožu izstrādes sākās no viena specializēta klona in vitro iegūto šūnu funkcionālās aktivitātes in vivo pētījumi. Proliferējošs ESŠ klons ģenerē migrējošu cilmes šūnu populācijas, kas patiešām spēj aktīvi integrēties recipienta audu bojājumu zonās, ko izmanto reģeneratīvi plastiskajā medicīnā. Ir noskaidrots, ka DOPA neironu transplantācija melnās vielas masā samazina klīniskās izpausmes eksperimentālā hemiparkinsonisma gadījumā. Donora neironu cilmes šūnu reģionālās transplantācijas samazina muguras smadzeņu un galvas smadzeņu traumas vai sasituma izraisīto motorisko traucējumu pakāpi. Ir iegūti arī pirmie pozitīvie cilmes šūnu transplantācijas rezultāti demielinizējošo slimību gadījumā. Šķiet, ka ESŠ reģeneratīvi plastiskais potenciāls paver neierobežotas iespējas šūnu transplantācijas izmantošanai praktiskajā medicīnā. Tomēr, transplantējot ektopiskās zonās, ESŠ neizbēgami pārvēršas audzējos. Teratomas veidojas, kad ESŠ tiek injicētas subkutāni imūndeficīta pelēm. Kad singenētiskām pelēm zem sēklinieku kapsulas transplantē ESC suspensijas, veidojas arī teratomas, kas sastāv no dažādiem audiem, kuru šūnas ir visu trīs dīgļslāņu atvasinājumi. Šādās teratomās reducētas organoģenēzes procesi ir ārkārtīgi reti.

Vairāki pētījumi sniedz informāciju par agrīnu ESC atvasinājumu transplantācijas pozitīviem rezultātiem dzīvniekiem ar eksperimentālu patoloģiju. Šūnu neirotransplantācija, izmantojot ESC atvasinājumus, tiek tālāk attīstīta eksperimentos un pirmajos klīniskajos pētījumos, lai koriģētu funkcionālos traucējumus smadzeņu un mugurkaula traumu gadījumā, kā arī lai ārstētu siringomiēliju un multiplo sklerozi (Repin, 2001). Līdz ar in vitro neiroģenēzes tehnikas parādīšanos no ESC, embrionālo smadzeņu audu vietā tiek izstrādātas metodes neirosfēras atvasinājumu transplantācijai, kas iegūti no embrionālo nervu audu kultūrām. Šādas transplantācijas suspensijas ir ievērojami homogēnākas un satur specializētus neironu un neirogliju prekursorus.

Regulāri pievienojot retīnskābi 10 μg/ml devā barotnei 6 nedēļu laikā, cilvēka embrija-(terato)karcinomas līnijā NTERA-2 veidojas vairāk nekā 80% postmitotisko neironu. Neironu populācijas pilnīga homogenitāte tiek panākta, plūsmas šķirojot nobriedušus neironus, kas iezīmēti ar imunofenotipiskiem marķieriem, kas ļauj atbrīvoties no teratokarcinomas un nenobriedušu šūnu atliekām. Pēc transplantācijas dažādos eksperimentālo dzīvnieku smadzeņu reģionos šādi neironi ne tikai izdzīvo, bet arī integrējas reģionālajos neironu tīklos. Dzīvniekiem ar eksperimentāliem lokālu CNS defektu modeļiem neirotransplantācija mazina tādu cilvēka patoloģiju klīniskās izpausmes kā traumatiskas smadzeņu traumas, insulta, demielinizējošu slimību, iedzimtu smadzenīšu attīstības defektu, lipīdu un polisaharīdu nogulsnēšanās slimību sekas.

Lai optimizētu reģenerācijas procesus centrālās nervu sistēmas deģeneratīvu slimību gadījumā, tiek izstrādātas tehnoloģijas mielīnu producējošu oligodendrocītu iegūšanai no ESŠ. Pirmajā posmā tradicionāli tiek iekļauta ESŠ proliferācija ar transplantācijai nepieciešamā šūnu skaita reproducēšanu. Otrajā posmā tiek veikta mērķtiecīga šūnu diferenciācija mielīnu producējošu oligodendrocītu prekursoru populācijā, ko kontrolē selektīvi marķieru antigēni.

Paveras zināmas perspektīvas ESC atvasinājumu izmantošanai metožu izstrādē imūndeficīta korekcijai, ko izraisa ģenētiski defekti aizkrūtes dziedzera nobriešanā. Pētījumos ar izslēgšanas (rag 1) pelēm ar inducētu gēnu defektu - TCR gēnu V(D)J lokusu rekombinācijas mehānisma traucējumu, kas noved pie T limfocītu funkcijas zuduma, agrīno ESC atvasinājumu transplantācija dzīvnieku aizkrūtes dziedzerī atjauno normālu imūnklonu populāciju nobriešanu, kas ir atbildīgas par šūnu imunitāti. Pašlaik tiek veikti klīniskie pētījumi par in vitro iepriekš sagatavotu ESC transplantāciju letālu iedzimtu anēmiju ārstēšanai bērniem.

Iebildumi pret cilmes šūnu transplantācijas strauju ieviešanu klīnikā ir balstīti uz ierobežoto stabilo cilvēka embrionālo cilmes šūnu līniju skaitu un nepieciešamību pēc to standartizācijas. Lai palielinātu standartizētu ESC līniju, kā arī pieauguša cilvēka cilmes šūnu tīrību, tiek ierosināts izmantot līniju atlases metodi, kuras pamatā ir īsu tandēma DNS atkārtojumu molekulārā ģenētiskā analīze. Ir arī jāpārbauda ESC līnijas attiecībā uz nelielu hromosomu pārkārtojumu un ģenētisko mutāciju klātbūtni, kuru iespējamība šūnu kultūras apstākļos ir diezgan augsta. Tiek izvirzīta tēze par obligātu visu veidu ESC un reģionālo pluripotento cilmes šūnu īpašību testēšanu, jo to reprodukcija in vitro var izraisīt jaunu īpašību rašanos, kas nav raksturīgas embrionālajām cilmes šūnām vai galīgajiem audiem. Jo īpaši tiek pieņemts, ka ilgstoša kultivēšana vidē ar citokīniem tuvina ESC līnijas audzēja šūnām, jo tās piedzīvo līdzīgas izmaiņas šūnu cikla regulācijas ceļos, iegūstot spēju veikt neierobežotu skaitu šūnu dalīšanos. Daži autori, pamatojoties uz audzēja attīstības potenciālu, uzskata agrīnu embrionālo cilmes šūnu atvasinājumu transplantāciju cilvēkiem par neapdomīgu. Viņuprāt, daudz drošāk ir izmantot apņēmīgus ESC pēctečus, t. i., diferencētu šūnu progenitoru līnijas. Tomēr pašlaik vēl nav izstrādāta uzticama metode stabilu cilvēka šūnu līniju iegūšanai, kas diferencējas vēlamajā virzienā.

Tādējādi literatūrā parādās arvien vairāk datu par cilvēka embriju cilmes šūnu atvasinājumu transplantācijas pozitīvo terapeitisko efektu. Tomēr daudzi no šiem pētījumiem tiek pārskatīti un kritizēti. Daži pētnieki uzskata, ka agrīno klīnisko pētījumu rezultāti ir provizoriski un norāda tikai uz to, ka cilmes šūnas spēj labvēlīgi ietekmēt konkrētas slimības klīnisko gaitu. Tāpēc ir nepieciešams iegūt datus par šūnu transplantācijas attāliem rezultātiem. Kā arguments tiek minēti klīniskās neirotransplantoloģijas attīstības posmi. Patiešām, sākumā literatūrā dominēja publikācijas par embriju smadzeņu fragmentu transplantācijas augsto efektivitāti Parkinsona slimības gadījumā, bet pēc tam sāka parādīties ziņojumi, kas noliedz pacientu smadzenēs transplantētu embriju vai augļa nervu audu terapeitisko efektivitāti.

Pirmie klīniskie pētījumi tika veikti, lai novērtētu no NTERA-2 teratokarcinomas ESŠ iegūtu neiroblastu transplantācijas drošību, kuru nenobriedušās šūnas tika pakļautas proliferācijai kultūrā, līdz uzkrājās 100 miljonu šūnu masa. Dažas no šādā veidā iegūtajām šūnām tika izmantotas fenotipa raksturošanai un šūnu piemaisījumu noteikšanai, kā arī iespējama piesārņojuma ar vīrusiem un baktērijām pārbaudei. LIF un augļa stromas šūnu barotnes slānis tika izņemti no barotnes, un tika radīti apstākļi mērķtiecīgai ESŠ diferenciācijai neiroblastos, izmantojot citokīnu un augšanas faktoru kombināciju. Pēc tam neiroblasti tika attīrīti no nenobriedušām teratokarcinomas šūnām, izmantojot plūsmas šūnu šķirotāju. Pēc transplantēto šūnu sekundārās attīrīšanas un fenotipa raksturošanas neiroblastu suspensija (10-12 miljoni) tika injicēta pacientu smadzeņu bazālajā kodolā (septītajā mēnesī pēc hemorāģiskā insulta), izmantojot īpašu mikrokanulu un šļirci stereotaksijas un datortomogrāfijas kontrolē. Pēc transplantācijas viena gada skrīnings par neironu transplantācijas sekām insulta zonā neatklāja nekādas blakusparādības vai nevēlamas blakusparādības. Pusei pacientu novēroja motorisko funkciju uzlabošanos laika posmā no 6 līdz 12 mēnešiem pēc transplantācijas. Pozitīvas klīniskās izmaiņas bija saistītas ar palielinātu asins piegādi insulta zonai pēc šūnu transplantācijas: fluorescenti iezīmētas 2-dezoksiglikozes absorbcijas vidējais pieaugums saskaņā ar pozitronu emisijas tomogrāfiju sasniedza 18%, bet dažiem pacientiem - 35%.

Tomēr ASV Nacionālie veselības institūti veica neatkarīgu pētījumu par neirotransplantācijas klīnisko efektivitāti pacientiem ar parkinsonismu. Pirmās grupas pacientiem tika transplantēti embrionālo nervu audu posmi, kas ražo dopamīnu, savukārt otrajai pacientu grupai tika veikta fiktīva operācija. Rezultāti liecina par šādas neirotransplantācijas nulles klīnisko efektivitāti, neskatoties uz to, ka dopamīnu ražojošie embrionālie neironi recipientu smadzenēs izdzīvoja. Turklāt 2 gadus pēc embrionālo nervu audu transplantācijas 15% pacientu attīstījās pastāvīga diskinēzija, kas placebo grupas pacientiem nebija novērojama (Cilmes šūnas: zinātnes progress un nākotnes pētījumu virzieni. Nat. Inst, of Health. USA). Novērojumi par slimības tālāku attīstību šiem pacientiem turpinās.

Daži autori pretrunīgos literatūras datus par neirotransplantācijas klīniskās efektivitātes novērtējumu saista ar atšķirīgām pieejām pacientu grupu atlasē, nepietiekamu metožu izvēli viņu stāvokļa objektīvai novērtēšanai un, pats galvenais, ar atšķirīgiem embrionālo nervu audu attīstības periodiem un dažādām smadzeņu zonām, no kurām šie audi tika iegūti, atšķirīgiem transplantāta izmēriem un ķirurģiskās iejaukšanās metodoloģiskajām iezīmēm.

Jāatzīmē, ka mēģinājumi tieši transplantēt pluripotentas embrionālās cilmes šūnas žurku smadzeņu striatuma reģionā ar eksperimentālu hemiparkinsonismu bija saistīti ar ESŠ proliferāciju un to diferenciāciju par dopamīnerģiskiem neironiem. Jāpieņem, ka jaunizveidotie neironi tika efektīvi integrēti neironu tīklos, jo pēc ESŠ transplantācijas tika novērota uzvedības anomāliju un motorās asimetrijas korekcija apomorfīna testā. Tajā pašā laikā daži dzīvnieki nomira transplantēto ESŠ pārveidošanās dēļ par smadzeņu audzējiem.

ASV Nacionālās un Medicīnas akadēmiju eksperti, ASV Nacionālā veselības institūta speciālisti uzskata, ka ESC klīniskais potenciāls ir pelnījis visnopietnāko uzmanību, taču uzstāj uz nepieciešamību veikt detalizētu to īpašību, komplikāciju iespējamības un ilgtermiņa seku izpēti eksperimentos ar atbilstošiem cilvēku slimību bioloģiskajiem modeļiem (Cilmes šūnas un nākotnes reģeneratīvā medicīna, National Academy Press.; Cilmes šūnas un nākotnes pētījumu virzieni, Nat. Inst, of Health USA).

No šī viedokļa ir svarīgi, ka salīdzinošā histoloģiskā analīze par eksperimentāliem teratomām, kas iegūtas, transplantējot ESC suspensiju sēkliniekos, ar teratomām, kas izveidojušās agrīna embrija transplantācijas rezultātā, kas arī satur ESC, parādīja, ka ESC, neatkarīgi no to izcelsmes avota vai mijiedarbības ar noteiktām apkārtējām šūnām, īsteno savu tumorogēno potenciālu vienādi. Ir pierādīts, ka šādām teratomām ir klonāla izcelsme, jo audzēji, kas sastāv no visu trīs dīgļslāņu atvasinājumiem, var rasties no vienas ESC (Rega, 2001). Jāatzīmē, ka, transplantējot klonētas ESC ar normālu kariotipu imūndeficīta pelēm, veidojās arī teratomas, kas sastāvēja no dažāda veida diferencētām somatiskajām šūnām. Šie eksperimentālie dati ir nevainojams pierādījums teratomu klonālajai izcelsmei. No attīstības bioloģijas viedokļa tie norāda, ka nevis vairākas specializētas cilmes šūnas, bet gan viena pluripotenta cilmes šūna darbojas kā visu trīs dīgļslāņu, kas veido teratomu, diferencētu atvasinājumu avots. Tomēr ceļā uz praktisku šūnu transplantāciju šo pētījumu rezultāti ir, ja ne aizliedzoši, tad brīdinoša zīme par iespējamām briesmām, jo ESŠ vai primitīvo dzimumšūnu inokulācija dažādos pieaugušu imūndeficīta peļu audos neizbēgami izraisa audzēju attīstību no transplantētām cilmes šūnām. Ektopiski transplantētu ESŠ neoplastisku deģenerāciju pavada diferencētu šūnu satelītu populāciju rašanās - pateicoties ESŠ un cilmes šūnu klonu daļējai diferenciācijai specializētās līnijās. Interesanti, ka, transplantējot ESŠ skeleta muskuļos, neironi visbiežāk veidojas blakus teratokarcinomas šūnām. Tomēr ESŠ ievadīšana dalošā olšūnā vai blastocistā notiek ar pilnīgu šūnu integrāciju embrijā bez neoplastisku elementu veidošanās. Šajā gadījumā ESŠ tiek integrētas praktiski visos embrija orgānos un audos, ieskaitot dzimumorgānu aizmetni. Šādi allofēna dzīvnieki pirmo reizi tika iegūti, ievadot teratokarcinomas 129 šūnas agrīnos embrijos 8-100 šūnu stadijās. Alofēna pelēm no donora ESŠ iegūtas heterogēnu šūnu populācijas ir integrētas kaulu smadzeņu, zarnu, ādas, aknu un dzimumorgānu audos, kas ļauj eksperimentā radīt pat starpsugu šūnu himēras. Jo īsāks ir agrīnā embrija attīstības periods, jo augstāks ir šūnu himerizācijas procents, un visaugstākā himerizācijas pakāpe novērota alofēna embrija hematopoētiskajā sistēmā, ādā, nervu sistēmā, aknās un tievajās zarnās. Pieauguša organisma audi, kas no recipienta imūnsistēmas ir aizsargāti ar histohematiskajām barjerām, ir uzņēmīgi pret himerizāciju:Primāro dzimumšūnu transplantācija sēklinieku parenhīmā notiek ar donora cilmes šūnu iekļaušanu recipienta germinālajā audu slānī. Tomēr, transplantējot ESC blastocistā, dzimumorgānu himērisku rudimentu veidošanās ar donora primāro dzimumšūnu ģenerēšanu nenotiek. ESC pluripotence, radot īpašus apstākļus, var tikt izmantota arī klonēšanai: peļu ESC transplantācija 8-16 šūnu peļu embrijā, kurā šūnu mitozes bloķē citokalsīns, veicina normālas embriogenēzes īstenošanu ar embrija attīstību no donora ESC.

Tāpēc alternatīva allogēnai ESŠ transplantācijai ir terapeitiskā klonēšana, kuras pamatā ir somatisko šūnu kodolu transplantācija enukleētā olšūnā, lai izveidotu blastocistu, no kuras iekšējās šūnu masas pēc tam tiek izolētas somatiskā kodola donoram ģenētiski identiskas ESŠ līnijas. Tehniski šī ideja ir diezgan īstenojama, jo iespēja izveidot ESŠ līnijas no blastocistām, kas iegūtas pēc somatisko kodolu transplantācijas enukleētās olšūnās, ir atkārtoti pierādīta eksperimentos ar laboratorijas dzīvniekiem (Nagy, 1990; Munsie, 2000). Jo īpaši pelēm, kurām ir homozigota rag2 gēna mutācija, par kodolu donoriem tika izmantoti fibroblasti, kas iegūti, kultivējot subepidermālas audu šūnas, un šie šūnas tika transplantētas enukleētās olšūnās. Pēc olšūnu aktivācijas "zigota" tika kultivēta līdz blastocistas izveidošanai, no kuras iekšējās šūnu masas tika izolētas ESŠ un pārnestas uz šūnu līniju, kas ir nullizigota mutanta gēnam (rag2~/~). Šādās ESŠ viena alēļgēna mutācija tika koriģēta ar homologās rekombinācijas metodi. Pirmajā eksperimentu sērijā embriju ķermeņi tika iegūti no ESŠ ar rekombinantu atjaunotu gēnu, to šūnas tika transfektētas ar rekombinantu retrovīrusu (HoxB4i/GFP) un pēc reprodukcijas tika ievadītas rag2~/~ peļu vēnā. Otrajā sērijā tetraploīdie blastomēri tika agregēti ar ģenētiski modificētām ESŠ un transplantēti recipientu mātītēm. Iegūtās imūnkompetentās peles kalpoja par kaulu smadzeņu donoriem transplantācijai rag2~/~ mutantu pelēm. Abās sērijās rezultāts bija pozitīvs: pēc 3-4 nedēļām visām pelēm tika atrastas nobriedušas normālas mieloīdas un limfoīdas šūnas, kas spēj producēt imūnglobulīnus. Tādējādi somatisko šūnu kodolu transplantāciju oocītos var izmantot ne tikai ESŠ līniju iegūšanai, bet arī citogenoterapijai - iedzimtu anomāliju korekcijai, izmantojot ESŠ kā vektoru korektīvās ģenētiskās informācijas transportēšanai. Taču šim šūnu transplantācijas virzienam, papildus bioētiskajām problēmām, ir arī savi ierobežojumi. Nav skaidrs, cik droša būs terapeitiski klonētu šūnu transplantācija ar genotipu, kas ir identisks konkrēta pacienta genotipam, jo šādas šūnas var ieviest mutācijas, kas rada noslieci uz citām slimībām. Normālas cilvēka olšūnas joprojām ir grūti pieejams objekts, turpretī pat transplantējot somatiskos kodolus dzīvnieku olšūnās, kurām izņemts kodols, tikai 15–25 % no konstruētajām "zigotām" attīstās līdz blastocistas stadijai. Pagaidām nav noteikts, cik blastocistu ir nepieciešams, lai iegūtu vienu pluripotentu klonētu ESC līniju. Jāatzīmē arī augstās finansiālās izmaksas, kas saistītas ar terapeitiskās klonēšanas metodoloģijas sarežģītību.

Noslēgumā jāatzīmē, ka ESŠ genoma pluripotence ar hipometilētu DNS ir apvienota ar augstu telomerāzes aktivitāti un īsu šūnu cikla C^ fāzi, kas nodrošina to intensīvu un potenciāli bezgalīgu reprodukciju, kuras laikā ESŠ saglabā diploīdu hromosomu komplektu un "juvenīlu" fenotipisko īpašību kopumu. ESŠ klonālā augšana kultūrā netraucē to diferenciāciju nevienā specializētā organisma šūnu līnijā, kad proliferācija tiek apturēta un tiek pievienoti atbilstoši regulējošie signāli. ESŠ restrikcijas diferenciācija somatiskajās šūnu līnijās in vitro tiek realizēta bez mezenhīma līdzdalības, apejot Nohtejus, ārpus organoģenēzes un bez embriju veidošanās. ESŠ ārpusdzemdes ievadīšana in vivo neizbēgami noved pie teratokarcinomu veidošanās. ESŠ transplantācija blastocistā vai agrīnā embrijā notiek ar to integrāciju ar embrionālajiem audiem un stabilu tā orgānu himerizāciju.

Reģeneratīvi plastiskās tehnoloģijas, kuru pamatā ir šūnu transplantācija, ir šūnu bioloģijas, attīstības bioloģijas, eksperimentālās ģenētikas, imunoloģijas, neiroloģijas, kardioloģijas, hematoloģijas un daudzu citu eksperimentālās un praktiskās medicīnas nozaru pārstāvju interešu krustpunkts. Svarīgākie eksperimentālo pētījumu rezultāti pierāda cilmes šūnu pārprogrammēšanas iespēju ar mērķtiecīgu to īpašību maiņu, kas paver perspektīvas citodiferenciācijas procesu kontrolei, izmantojot augšanas faktorus - miokarda reģenerācijai, CNS bojājumu atjaunošanai un aizkuņģa dziedzera saliņu aparāta funkcijas normalizēšanai. Tomēr, lai plaši ieviestu ESC atvasinājumu transplantāciju praktiskajā medicīnā, ir nepieciešams sīkāk izpētīt cilvēka cilmes šūnu īpašības un turpināt eksperimentus ar ESC eksperimentālos slimību modeļos.

Bioētiskos jautājumus un allogēno šūnu transplantāta atgrūšanas problēmu varētu atrisināt atklātais pieauguša organisma reģionālo cilmes šūnu genoma plastiskums. Tomēr sākotnējā informācija, ka, transplantējot aknās izolētas un rūpīgi raksturotas hematopoētiskas autologas šūnas, no kurām tiek iegūti jauni hepatocīti, tās integrējas aknu daiviņās, tagad tiek pārskatīta un kritizēta. Neskatoties uz to, ir publicēti dati, ka neirālo cilmes šūnu transplantācija aizkrūtes dziedzerī izraisa jaunu donoru T- un B-limfocītu asnu veidošanos, un smadzeņu neirālo cilmes šūnu transplantācija kaulu smadzenēs noved pie hematopoētisku asnu veidošanās ar ilgstošu donoru mielo- un eritropoēzi. Līdz ar to pluripotentās cilmes šūnas, kas spēj pārprogrammēt genomu ESŠ potenciālam, var saglabāties pieauguša organisma orgānos.

ESC iegūšanas avots medicīniskiem nolūkiem joprojām ir cilvēka embrijs, kas iepriekš nosaka neizbēgamu jaunu morālo, ētisko, juridisko un reliģisko jautājumu krustpunktu cilvēka dzīvības izcelsmes vietā. ESC atklāšana ir devusi spēcīgu impulsu atjaunot asas diskusijas par to, kur atrodas robeža starp dzīvajām šūnām un matēriju, būtni un personību. Tajā pašā laikā nav universālu normu, noteikumu un likumu attiecībā uz ESC izmantošanu medicīnā, neskatoties uz atkārtotiem mēģinājumiem tos izveidot un pieņemt. Katra valsts savas likumdošanas ietvaros risina šo problēmu patstāvīgi. Savukārt ārsti visā pasaulē turpina mēģināt izvest reģeneratīvi plastisko medicīnu ārpus šādu diskusiju tvēruma, galvenokārt izmantojot pieaugušo cilmes šūnu rezerves, nevis embrionālās cilmes šūnas.

Nedaudz par embrionālo cilmes šūnu izolēšanas vēsturi

Terato(embrija)karcinomas šūnas tika izolētas no spontāni radušamies 129/ter-Sv peļu sēklinieku teratomām, spontāniem Lt/Sv peļu olnīcu teratomām un no teratomām, kas iegūtas no ektopiski transplantētām embrionālajām šūnām vai audiem. Starp šādā veidā iegūtajām stabilajām peļu terato(embrija)karcinomas šūnu līnijām dažas bija pluripotentas, citas diferencējās tikai vienā specifiskā šūnu tipā, bet dažas bija pilnībā nespējīgas citodiferencēties.

Savulaik uzmanība tika pievērsta pētījumiem, kuru rezultāti liecināja par iespēju atgriezt terato-embrija karcinomas šūnas normālā fenotipā pēc to ievadīšanas attīstoša embrija audos, kā arī darbam pie ģenētiski modificētu terato-embrija karcinomas šūnu in vitro izveides, ar kuru palīdzību tika iegūtas mutantu peles cilvēka iedzimtās patoloģijas bioloģiskai modelēšanai.

Lai izolētu terato-(embrio)karcinomas šūnu līnijas, tika izmantota kondicionēta suspensijas kultivēšana. Kultūrā terato-(embrio)karcinomas šūnas, tāpat kā ESC, aug, veidojot embriju ķermeņus, un līnijas pārnešanai nepieciešama obligāta disociācija, saglabājot pluripotenci uz embriju fibroblastu barotnes slāņa vai suspensijas kultivēšanas laikā kondicionētā vidē. Pluripotentu terato-(embrio)karcinomas līniju šūnas ir lielas, sfēriskas, tām raksturīga augsta sārmainās fosfatāzes aktivitāte, tās veido agregātus un spēj diferencēties daudzvirzienu veidā. Ievadot blastocistā, tās agregējas ar morulu, kas noved pie himērisku embriju veidošanās dažādu orgānu un audu sastāvā, kuru sastāvā ir atrodami terato-(embrio)karcinomas šūnu atvasinājumi. Tomēr lielākā daļa šādu himērisku embriju iet bojā dzemdē, un izdzīvojušo jaundzimušo himēru orgānos svešas šūnas tiek konstatētas reti un ar zemu blīvumu. Vienlaikus strauji palielinās audzēju (fibrosarkomas, rabdomiosarkomas, cita veida ļaundabīgu audzēju un aizkuņģa dziedzera adenomas) sastopamība, un audzēja deģenerācija bieži notiek himērisku embriju intrauterīnās attīstības periodā.

Lielākā daļa terato-(embrio)karcinomas šūnu normālu embriju šūnu mikrovidē gandrīz dabiski iegūst ļaundabīgas neoplastiskas īpašības. Tiek uzskatīts, ka neatgriezeniska ļaundabīga audzēja veidošanās ir saistīta ar protoonkogēnu aktivāciju strukturālu pārkārtojumu procesā. Viens no izņēmumiem ir embriokarcinomas līnijas SST3 šūnas, kas iegūtas no peļu sēklinieku teratomām (līnija 129/Sv-ter), kurām piemīt augsta spēja integrēties embrija audos un orgānos bez sekojošas audzēja veidošanās himēriskās pelēs. Terato-(embrio)karcinomas šūnu līniju atvasinājumi himēriskās pelēs praktiski nepiedalās primāro gonocītu veidošanā. Acīmredzot tas ir saistīts ar augsto hromosomu aberāciju biežumu, kas raksturīgs lielākajai daļai terato-(embrio)karcinomas līniju, kuru šūnās novēro gan aneiploīdiju, gan hromosomu anomālijas.

Laboratorijas apstākļos tika iegūtas vairākas stabilas cilvēka terato-embrija karcinomas šūnu līnijas, kam raksturīga pluripotence, augsta proliferatīvā aktivitāte un spēja diferencēties augšanas laikā kultūrās. Konkrēti, cilvēka terato-embrija karcinomas šūnu līnija NTERA-2 tika izmantota, lai pētītu neironu citodiferenciācijas mehānismus. Pēc šīs līnijas šūnu transplantācijas jaundzimušo žurku priekšsmadzeņu subventrikulārajā reģionā tika novērota to migrācija un neiroģenēze. Tika pat mēģināts transplantēt neironus, kas iegūti, kultivējot terato-embrija karcinomas līnijas NTERA-2 šūnas, pacientiem ar insultu, kas, pēc autoru domām, uzlaboja slimības klīnisko gaitu. Tajā pašā laikā netika konstatēti terato-embrija karcinomas līnijas NTERA-2 transplantēto šūnu ļaundabīguma gadījumi pacientiem ar insultu.

Pirmās nediferencētu pluripotentu peļu embrionālo cilmes šūnu līnijas ieguva 20. gs. astoņdesmito gadu sākumā, izolējot tās no blastocistas iekšējās šūnu masas — embrioblasta. Izolētās ESC līnijas ilgstoši saglabāja pluripotenci un spēju diferencēties dažādos šūnu tipos faktoru ietekmē īpašā barotnē.

Pats termins “embrionālās pluripotentās cilmes šūnas” pieder Lerojam Stīvensam, kurš, pētot tabakas darvas ietekmi uz audzēju attīstības biežumu, pievērsa uzmanību sēklinieku teratokarcinomas spontānai rašanās lineārām (129/v) pelēm kontroles grupā. Sēklinieku teratokarcinomu šūnām bija raksturīgs augsts proliferācijas ātrums, un vēdera dobuma šķidruma klātbūtnē tās spontāni diferencējās, veidojot neironus, keratinocītus, hondrocītus, kardiomiocītus, kā arī matu un kaulu fragmentus, bet bez jebkādām atbilstošo audu sakārtotas citoarhitektūras pazīmēm. Ievietojot kultūrā, teratokarcinomas šūnas auga kā pluripotenti kloni, kas nebija piesaistīti substrātam, un veidoja embriju ķermeņus, pēc tam tās pārstāja dalīties un piedzīvoja spontānu, nesakārtotu diferenciāciju neironos, glijās, muskuļu šūnās un kardiomiocītos. Stīvenss atklāja, ka peļu teratokarcinoma 129/v satur mazāk nekā 1% šūnu, kas spēj diferencēties dažādās specializētās somatiskās līnijās, un pati diferenciācija ir atkarīga no faktoriem, kas tās ietekmē (peritoneālā šķidruma sastāvs, nobriedušu šūnu produkti vai kultūrai pievienotie audi). Leroja Stīvensona hipotēze par dīgļlīnijas embrionālo cilmes šūnu klātbūtni teratokarcinomas šūnās tika apstiprināta: embrioblastu šūnu suspensija no preimplantācijas embrijiem pieaugušu peļu audos veidoja teratokarcinomas, un no tām izolētas tīras šūnu līnijas pēc intraperitoneālas ievadīšanas recipienta dzīvniekiem diferencējās neironos, kardiomiocītos un citās somatiskās šūnās, kas iegūtas no visiem trim dīgļslāņiem. In vivo eksperimentos ESŠ (iegūtu no embrioblasta, bet ne no trofoblasta) transplantācija peļu embrijos no citas līnijas blastomēru stadijās 8.-32. izraisīja himērisku dzīvnieku dzimšanu (bez audzēju attīstības), kuru orgānos tika atrasti donora audu asni. Himērisms tika novērots pat dīgļšūnu līnijā.

Primārās cilmes šūnas, kas izolētas no peles embrija dzimumšūnām, pēc morfoloģijas, imunoloģiskā fenotipa un funkcionālajām īpašībām atbilda ESŠ, kas iegūtas ar Stīvensona metodi no teratokarcinomas un embrioblasta. Himērās, kas dzimušas pēc ESŠ ievadīšanas blastocistā, orgānu allofēna morfoģenēzei bija raksturīga donora un recipienta strukturālo un funkcionālo vienību - aknu, plaušu un nieru - mozaīkas mija. Dažos gadījumos tika novērota zarnu kriptu vai aknu daivu veidošanās, kas sastāvēja gan no recipienta, gan donora šūnām. Tomēr morfoģenēze vienmēr tika realizēta saskaņā ar sugas, kurai piederēja recipients, ģenētisko programmu, un himērisms aprobežojās tikai ar šūnu līmeni.

Tad tika konstatēts, ka ESŠ proliferācija bez citodiferenciācijas uz mezenhīma atvasinātu šūnu (augļa fibroblastu) barotnes slāņa notiek ar obligātu LIF klātbūtni selektīvās barības vielās, kas selektīvi nodrošina tikai cilmes un cilmes šūnu izdzīvošanu, savukārt lielākā daļa specializēto šūnu elementu iet bojā. Izmantojot šādas metodes, 1998. gadā Džeimss Tomsons izolēja piecas nemirstīgas embrionālo cilmes šūnu līnijas no cilvēka blastocistas iekšējās šūnu masas. Tajā pašā gadā Džons Gerharts izstrādāja metodi nemirstīgu ESŠ līniju izolēšanai no četru līdz piecu nedēļu vecu cilvēka embriju dzimumorgānu tuberkulozes. Pateicoties to unikālajām īpašībām, tikai divus gadus vēlāk embrionālās cilmes šūnas un definitīvo audu cilmes šūnas sāka izmantot reģeneratīvās medicīnas un gēnu terapijas praksē.