Eksperimentāls darbs ar alogēnu keratinocītu transplantāciju uz mākslīgi radītām balto žurku rētām

Vēlme izmantot šūnu potenciālu un nepieciešamība atrast jaunas efektīvas metodes rētu estētiskā izskata uzlabošanai radīja ideju mēģināt izpētīt keratinocītu transplantācijas iespēju uz rētu virsmām.

Lai pierādītu keratinocītu kultūras izmantošanas iespējamību rētu izskata uzlabošanai, tika veikts eksperimentāls pētījums ar baltām laboratorijas žurkām, kurām tika izveidotas rētu virsmas. Žurku rētas modelis tika iegūts, sadziedējot mākslīgi radītas brūces uz muguras, gar mugurkaulu. Žurkām tika izgriezti identiski ādas gabaliņi, 2x3 cm lielumā. 2,5 mēnešus pēc "rētu modelēšanas" operācijas žurkām tika veikta dermabrāzija (rētas augšējo slāņu noņemšana, izmantojot termokaustisko metodi), un tika transplantēti allogēni keratinocīti, kas tika izolēti no žurku mazuļu ādas 2-4 dienas pēc dzimšanas.

Žurku epidermas šūnu izolēšana un kultivēšana tika veikta Krievijas Zinātņu akadēmijas Citoloģijas institūta šūnu tehnoloģiju laboratorijā, izmantojot šādu tehnoloģiju.

Āda tika mazgāta Hanka fizioloģiskajā šķīdumā, kas satur 200 U/ml gentamicīna, un sagriezta mazos gabaliņos, 0,2–0,5 cm2 platībā ^. Ādas gabaliņus inkubēja 0,5% dispāzes šķīdumā līdzsvarotā sāls fosfāta buferšķīdumā 37°C temperatūrā 1 stundu. Pēc tam gabaliņus pārvietoja uz Dulbeko fosfāta buferšķīdumu, un epidermu atdalīja no dermas. Epidermu inkubēja 0,125% tripsīna šķīdumā 10–15 minūtes, maisot ar ātrumu 50 apgr./min, pēc tam enzīmu darbību apturēja, pievienojot 5% fetāla liellopa serumu. Viena trešdaļa no iegūtās šūnu suspensijas tika izmantota tīrā veidā vienam no transplantācijas uz rētām variantiem, otrā trešdaļa tika audzēta uz bioloģiski saderīgiem sadzīves plēvju pārklājumiem "Polypor", bet trešā – uz Petri trauciņiem bez substrāta. Iegūto rētu dermabrāzijas operācija žurkām ar sekojošu žurku epidermas šūnu transplantāciju uz tām tika veikta ētera anestēzijā, izmantojot termisko kateriju.

Pirmajai žurku grupai pēc dermabrāzijas uz nopulētās, ar fizioloģisko šķīdumu mazgātās un nosusinātās rētas virsmas tika uzlikti sterili kambrika gabaliņi, uz kuriem tika uzklāta sakratīta alogēnu žurku epidermocītu suspensija ar koncentrāciju 1,5 miljoni šūnu uz 1 ml (saskaņā ar Citoloģijas institūta datiem). Kembrika gabaliņi tika novietoti uz nopulētās rētas tā, lai šūnas atrastos uz rētas virsmas. Virsū tika uzlikts no vairākiem marles slāņiem veidots pārsējs, kas tika piešūts pie rētas malām.

Daļa no iegūtās šūnu suspensijas tika iesēta Petri trauciņos uz sterilām Polypore plēvēm, kas izgrieztas trauciņu formā, otra daļa - uz Petri trauciņiem bez plēves. Kultivēšana tika veikta FAD vidē, kas sastāvēja no DMEM un F12 barotnes maisījuma attiecībā 3:1, pievienojot 10% fetāla liellopa seruma, 5 μg/ml insulīna (Sigma), 0,5 μg/ml hidrokortizona hemisukcināta (Sigma). 10 μg/ml epidermas augšanas faktora EGF (RAS Citoloģijas institūts, Sanktpēterburga). Otrā un trešā žurku grupa, katrā 7 īpatņi, tika operētas 6 dienas pēc pirmās. Līdz tam laikam no iesēto keratinocītu suspensijas Petri trauciņos bija izveidojušies daudzslāņu slāņi, kas tika transplantēti žurkām. Otrajai grupai tika transplantēti epidermocīti uz plēves, trešajai - daudzslāņu slānis bez substrāta. Pēc 7 dienām iegūtie daudzslāņu allogēnu keratinocītu (MPALK) slāņi, kas bija iesēti uz "Polypore" plēvēm, tika transplantēti kā kultūra tieši uz brūces virsmas. Virsū plēvi, lai tā nenoplīstu, nostiprināja ar daudzslāņu marles saiti un piešūva žurku ādai.

Pirms keratinocītu transplantācijas trešajai žurku grupai, kas audzēta bez substrāta, PAC tika atdalīts no Petri trauciņa apakšas, apstrādājot to ar dispāzi, kurai piemīt spēja selektīvi pārtraukt dermas-epidermas saites. Iedarbojoties uz daudzslāņu slāni, dispāze pārtrauc bazālā slāņa šūnu savienojumu ar Petri trauciņa apakšu un daudz mazāk ietekmē starpšūnu savienojumus, kas ļauj pilnībā "noņemt" slāni. Daudzslāņu šūnu slāņa atdalīšana ar dispāzi tika veikta šādi. Transporta barotne tika iztukšota no Petri trauciņiem, šūnu slāņi trīs reizes tika mazgāti ar barības vielu barotni, kas saturēja antibiotikas, jo īpaši gentamicīnu (0,2 mg/ml). Daudzslāņu slāņi tika piepildīti ar 0,125% dispāzes šķīdumu ("Sigma") un ievietoti termostatā, kur tos inkubēja t=37°C temperatūrā 20-30 minūtes. Baltas malas parādīšanās, kas lobās gar slāņa perifēriju, liecina par tā atdalīšanās procesa sākumu no Petri trauciņa malām un apakšas. Dažas minūtes pēc atdalīšanas procesa sākuma dispāzes šķīdums tika notecināts, epitēlija slāņi 2-3 reizes tika mazgāti ar barotni. Uz epidermas slāņa virsmas tika uzklāts sterila brūču pārsēja "Lita-color" gabaliņš, kas sagriezts krūzītes lielumā, un pie kura tika pielīmēts ar dispāzi atdalītais slānis, kas papildus ar lāpstiņu bija nolobīts no krūzītes apakšas. Izmantojot pinceti, slānis kopā ar salvetes "Lita-color" (Krievija) pārklājumu tika norauts no Petri trauciņa apakšas un uzmanīgi pārvietots uz sagatavotās rētas virsmas. Salvetes "Lita-color" satur gentamicīnu un eksolīnu (kolagēna ekstraktu), kas, samitrināti ar augšanas barotnes paliekām un pēc tam ar fizioloģisko šķīdumu, uzbriest un kļūst par mūsdienīgu brūču pārsēju, nodrošinot labu aizsardzību pret ārēju infekciju un ātru dzīšanu, pateicoties mitrumu absorbējošai struktūrai.

Uz Polypore plēvēm un Lita-color salvetēm tika uzlikti daudzslāņu marles pārsēji un piešūti pie žurku ādas spēcīgākai fiksācijai. Katra žurka tika ievietota atsevišķā būrī, lai radītu optimālus apstākļus tās uzturēšanai un transplantēto keratinocītu iesakņošanai. Žurku pārsēji, uz kuriem tika transplantēta suspensija un ar dispāzi noņemto epidermocītu daudzslāņu slānis, vairākas reizes dienā tika samitrināti ar sterilu fizioloģisko šķīdumu, lai radītu vislabvēlīgākos apstākļus šūnu iesakņošanai. Ņemot vērā, ka Polypore plēve bija ūdensnecaurlaidīga, otrās grupas žurku pārsēji netika samitrināti, kas bija viena no priekšrocībām salīdzinājumā ar transplantācijām bez plēvēm. Pārsēji tika noņemti pēc 10 dienām. Rētu klīniskā aina pēc šūnu transplantācijas maz atšķīrās no rētām bez transplantācijas, izņemot to rozā krāsu (dermabrāzijas dēļ) un lielāku lobīšanos. Šis fakts liecina, ka tūlīt pēc brūču pārsēju nokrišanas ar MPC rētā netika novērotas nekādas izmaiņas.

Biopsijas materiāla ņemšana no žurkām.

1, 2, 5 un 9 mēnešus pēc žurku allogēnu keratinocītu transplantācijas uz pulētām baltu žurku rētām tika ņemts materiāls histoloģiskai, citomorfoloģiskai un elektronmikroskopiskai izmeklēšanai. Kā kontrolei tika ņemti normālas žurku ādas un rētas paraugi bez šūnu transplantācijas. Žurku anestēzija tika veikta, izmantojot ētera anestēziju.

Pēc anestēzijas no iezīmētajām vietām, uz kurām, izmantojot 2 mm diametra biopsijas perforatoru, tika ņemti rētaudu gabaliņi, un ievietoti 2,5% glutaraldehīda šķīdumā, lai sagatavotu materiālu elektronmikroskopiskai izmeklēšanai. Histoloģiskai izmeklēšanai ņemtie audu gabaliņi tika ievietoti 10% neitrālā formalīna šķīdumā, pēc tam izlaisti caur spirtiem un iestrādāti parafīnā, pēc tam izgriezti īpaši plāni griezumi un apskatīti gaismas optiskajā mikroskopā.

Kontrole I. Normāla žurkas āda.

Lai saskatītu atšķirību starp normālas, ar rētām izmainītas žurkas ādas mikroskopisko attēlu un rētām noteiktā laikā pēc MPC transplantācijas, visos šī pētījuma posmos ir parādītas to fotogrāfijas un apraksti.

Normālas ādas epidermu veido 7–9 šūnu slāņi. Stratum corneum ir vidēja biezuma. Dažviet tas sastāv no 6–8 ragveida zvīņu slāņiem. Bazālo slāni veido cilindriskas šūnas ar lieliem, viegliem, regulāras formas kodoliem un vairākiem kodoliem. Skaidri izteikti ir desmosomāli savienojumi starp šūnām un ar bazālo membrānu. Zem precīzi definētas bazālās membrānas, kurai ir nelieli izaugumi subepidermālajā slānī, paralēli tai atrodas smalki kolagēna un elastīna šķiedru kūlīši, starp kuriem ir iegareni fibroblasti, mazi asinsvadi. Dziļākos slāņos kolagēna un elastīna šķiedru kūlīši atrodas dažādos virzienos. Starp tiem ir daudz asinsvadu ar plānām vienāda kalibra sieniņām, šūnu elementi (fibroblasti, tuklās šūnas, leikocīti). Liels skaits matu folikulu, tauku dziedzeri.

2. kontrole. Žurkas rēta, 2 mēnešus veca.

Klīniskā aina. Rētas ir gaiši rozā, ar lobīšanos, vietām saglabājušās kreveles. To laukums ir samazinājies kolagēna šķiedru saraušanās dēļ un ir kļuvis aptuveni 3,0–3,5 cm ^. Ādas piedēkļu nav.

Mikroskopisks attēls. Epidermu veido 3–5 salocīti šūnu slāņi, ko attēlo noapaļotas bazālās šūnas, viena subulata rinda, 1–2 granulētu šūnu rindas ar keratohialīna graudiem augšējā slānī, ir intracelulāras tūskas zonas. Stratum corneum ir nevienmērīgi mainījies no ļoti plāna līdz sabiezējušam. Rētas krokošanās ir novērojama rētaudu (saraušanās) dēļ. Krokas iekļūst papilārajā slānī un rada kārpiņu iespaidu. Robeža starp epidermu un dermu ir taisna līnija. Bazālā membrāna nav visur izsekojama. Subepidermālā apakšējā daļā un dziļākajos slāņos ir asinsvadi ar biezu, irdenu sienu, daudzi ir pamesti, ar stāzi. Ap asinsvadiem ir makrofāgu, fibroblastu uzkrāšanās. Makrofāgi ieskauj no kapilāriem atbrīvotos eritrocītus un fagocitē tos. Virspusējos slāņos ir mazi kapilāri. Zem epidermas kolagēna šķiedras ir brīvi izvietotas. Rētas dziļākajā slānī ir rupji kolagēna šķiedru kūlīši, starp kuriem ir daudz fibroblastu.

Žurkas rēta mēnesi pēc žurku keratinocītu transplantācijas.

Klīniskā aina. Rētas ir rozā krāsā, to laukums ir samazinājies, īpaši diametrā, un ir vidēji 2,5–3 cm2 ^. Nav matu un tauku dziedzeru.

Žurkām iegūtā materiāla mikroskopiskās izmeklēšanas dati ar MPaLK transplantāciju uz plēves un MPaLK bez substrāta ir praktiski identiski. Tomēr tīri tehniski darbs ar MPaLK bez substrāta ir daudz sarežģītāks un darbietilpīgāks nekā MPaLK audzēšana uz substrāta, tāpēc, tālāk pētot keratinocītu transplantācijas jautājumu uz rētām, par audzēšanas pamatu ("substrātus") izmantojām daudzslāņu kambriku.

Mikroskopisks attēls. Ir novērota epidermas sabiezēšana līdz 15-20 slāņiem, gandrīz līdz vidum keratinocītiem ir šaura, iegarena, vertikāla forma un kompakts izkārtojums. Bazālās šūnas atrodas nevienmērīgā līnijā. To kodoli ir gaiši, lieli, noapaļoti ar vienu vai diviem kodoliņiem, kas norāda uz to augsto sintētisko un proliferatīvo aktivitāti. Robeža starp epidermu un dermu ir taisna līnija. Dzelkšņainais slānis ir labi attīstīts, sastāv no 3-5 noapaļotu šūnu slāņiem, ir 2 kodoliņu šūnas.

Tūlīt zem bazālās membrānas blīvi izvietoti plāni kolagēna šķiedru saišķi, paralēli tiem ir liels skaits pamestu asinsvadu, dziļāk esošās kolagēna šķiedras ir rupjākas, savāktas blīvos saišķos. Daudz lielu fibroblastu, tuklo šūnu (2-3 redzes laukā), makrofāgu, leikocītu un pamestu asinsvadu, kuru sieniņas ir irdenas, ap tiem irdeni izvietotas kolagēna šķiedras. Dažos asinsvados ir stāze, izveidojušos elementu diapedēze. Ap asinsvadiem ir fibroblasti, atsevišķi limfocīti. Ādas piedēkļi nav.

Transplantējot keratinocītu suspensiju uz pulētas rētas, mikroskopiskais attēls atšķiras no iepriekšējā. Vairumam dzīvnieku epiderma ir plāna un sastāv no 5–6 šūnu slāņiem. Apakšējais slānis sastāv no neregulāras, daudzstūrainas formas šūnām ar apaļi neregulāras formas kodoliem. Subepidermālā slāņa stāvoklis ir līdzīgs tā stāvoklim dzīvnieku grupā bez MPALK transplantācijas.

Šajā gadījumā mēs varam runāt vai nu par šūnu transplantācijas procesu aizkavēšanos, vai par lielu šūnu zudumu, kas transplantētas suspensijas veidā. Līdz ar to tika izdarīts secinājums par rētu korekcijas nelietderību, transplantējot keratinocītus suspensijas veidā.

Žurkas rēta 2 mēnešus pēc žurku keratinocītu transplantācijas.

Klīniskā aina. Rēta izskatās plāna un delikāta. Vietām novērojama lobīšanās un zvīņaini plankumi.

Mikroskopisks attēls. Stratum corneum ir sabiezējis, vietām - hiperkeratoze. Epiderma ir sabiezējusi, sastāv no 12-20 šūnu rindām. Robeža starp epidermu un dermu ir taisna līnija. Smalkas kolagēna šķiedras zem epidermas atrodas diezgan blīvi. Rētas dziļākajos slāņos tās ir savāktas lielos rupjos saišķos. Subepidermālajā slānī parādās jauni asinsvadu veidojumi. Rētaudu apakšējos slāņos ir daudz pamestu asinsvadu, kas atrodas paralēli epidermas virsmai. Lieli fibroblasti ir vienmērīgi sadalīti rētas biezumā, ir milzu, daudzzaru, daudz makrofāgu.

Žurkas rēta 5 mēnešus pēc žurkas epidermas šūnu transplantācijas.

Klīniskā aina. Rēta izskatās vienmērīga, gluda, bez lobīšanās, ir atsevišķi matiņi, to blīvums ir lielāks rētas perifērijā, kas norāda uz matu folikulu marginālu ieaugšanu rētā un jaunu matu folikulu veidošanos. Rētu laukums turpina samazināties.

Mikroskopisks attēls. Epiderma joprojām ir bieza (15–20 slāņi, dažviet līdz 30), augšējos slāņos tā ir piepildīta ar keratohialīna graudiem. Skaidri redzama bazālā membrāna. Zem tās kolagēna šķiedras atrodas brīvi. Apakšējos slāņos kolagēns ir spēcīgāks un blīvāk iesaiņots. Starp kolagēna kūlīšiem ir daudz kapilāru. Augšējos slāņos ir samazinājies pamesto asinsvadu skaits. Epidermas un dermas savienojums ir nedaudz viļņains. Dažviet rētaudos ir dziļi epidermas izaugumi. Starp kolagēna šķiedrām ir redzami jaunizveidojušies asinsvadi. Parādās atsevišķi matu folikuli un tauku dziedzeri.

Žurkas rēta 9 mēnešus pēc žurkas epidermas MPA šūnu transplantācijas.

Klīniskā aina. Rētas ir kļuvušas ievērojami mazākas nekā agrākajos periodos, to laukums vidēji ir aptuveni 1,5–2,0 cm2 ^. Rētas ir nevienmērīgi klātas ar smalkiem matiņiem, īpaši perifērijā. Saglabājusies neliela smalku plātnīšu lobīšanās.

Mikroskopisks attēls.

Epiderma ir kļuvusi plānāka, to veido 6-8 šūnu rindas, pēc struktūras atgādina normālas žurkas ādas epidermu, tikai šūnu blīvums ir par 1 mm lielāks un tās ir mazākas. Bazālais slānis sastāv no mazām apaļcilindriskām šūnām. Bazālā membrāna ir labi izteikta, hemidesmosomas ir skaidri redzamas. Ir konstatēti epidermas izaugumi subepidermālajā slānī. Papilārais slānis ir izteikts visā rētas garumā. Šie fakti liecina, ka līdz šim laikam transplantēto keratinocītu saķere ar pamatā esošajiem rētaudiem ir kļuvusi daudz spēcīgāka. Tāpēc rētu aprūpe cilvēkiem ar MPALK transplantāciju 9 mēnešus pēc MPC transplantācijas var būt tradicionāla. Zem epidermas kolagēna šķiedras ir trauslākas nekā dziļajos slāņos. Ir parādījušies daudzi asinsvadi, īpaši virspusējie. Lielāku asinsvadu sienas ir sabiezējušas. Matu folikuli un tauku dziedzeri ir lielā daudzumā. Mikroskopiskais attēls atgādina dermai līdzīgus audus.

Eksperimentālā darba rezultāti un to apspriešana.

Šī darba gaitā uz mākslīgi izveidotām žurku ādas rētām pēc dermabrāzijas operācijas tika transplantēti dažādu formu keratinocīti - uz brūču pārklājumiem, kā suspensija uz kambrika un kā daudzslāņu slānis bez substrāta. Darbs tika veikts ar mērķi iegūt morfoloģiskus datus par transplantēto allogēnu keratinocītu ietekmi uz rētām, kā arī noteikt optimālas transplantācijas iespējas.

Tika konstatēts, ka visas trīs transplantācijas metodes ir iespējamas, taču MPAC transplantācija bez substrāta ir ļoti darbietilpīga procedūra, kuras laikā MPAC var tikt bojāts, kas ietekmē transplantācijas rezultātus. Turklāt šī transplantācijas metode izslēdz darbu uz lielām virsmām.

Keratinocītu suspensijas transplantācija ir daudz izmaksu ziņā efektīvāka metode, neprasa ilgstošu šūnu kultivēšanu un ir vienkārša mūsu piedāvātajā versijā, izmantojot sterilus kambris sagataves, kuru izmēri atbilst rētu lielumam. Terapeitiskās iedarbības aizkavēšanās, transplantējot šūnu suspensiju par aptuveni mēnesi, salīdzinot ar MPC uz brūces pārklājuma, nav būtisks faktors, ja ārstēšanas ilgums ir daudz mēnešu. Ir zināms, ka, transplantējot MPC apdegumu pacientiem, ādas struktūras transformācija notiek pakāpeniski un vairāku gadu laikā. Keratinocītu kultūras transplantācija uz brūču pārklājumiem ir ērtākā un daudzsološākā metode, bet arī ievērojami dārgāka. Turklāt pašlaik ir jāmeklē modernākas pārklājuma iespējas, kurām jābūt elastīgām, higroskopiskām, ar bakteriostatiskām vai baktericīdām īpašībām un bioloģiski neitrālām šūnām. Plēve "Polypor" - sadzīves plēves brūču pārklājuma starpposma versija, neskatoties uz dažām nepilnībām, ļāva mums eksperimentā pētīt žurku keratinocītu transplantāciju uz rētām un izdarīt secinājumus par šī rētu ārstēšanas virziena efektivitāti.

Autori, kuri transplantēja MPC uz apdegumu brūcēm, atzīmēja, ka pirmajā nedēļā pēc daudzslāņu keratinocītu slāņa transplantācijas uz dezinficētām brūcēm epiderma sabiezēja un stratificējās. Visi epidermas slāņi bija skaidri redzami. Interesanti, ka šūnu slāņu skaits transplantātos bija par 10–30% lielāks nekā ādas biopsijās. Autori atzīmēja keratohialīna granulu parādīšanos 5. dienā pēc MPC transplantācijas, bet bazālās membrānas un hemidesmosomu parādīšanos – jau 3. dienā.

J.Rives et al. (1994), Paramonov BA (1996); Kuznetsov NM et al. (1998) atklāja, ka agrīnās stadijās pēc MPC transplantācijas pacientiem ar pilna biezuma ādas defektiem pēc apdegumiem saikne starp dermu un epidermu ir ļoti vāja un taisna līnija, papilārais slānis nav sastopams. Līdz 2. mēneša beigām sāk veidoties seklas kārpas un ādas piedēkļi, saikne starp dermu un epidermu kļūst spēcīgāka. Literatūras dati liecina, ka alogēnu keratinocītu transplantācija uz brūcēm apdegumu pacientiem ir daudzsološa metode. Neskatoties uz to, ka alogēnu keratinocītu atgrūšana notiek, pēc dažādu autoru domām, 10 dienu līdz 3 mēnešu laikā, tie tomēr spēlē savu lomu brūces virsmas sadzīšanā, augšanas faktoru sekrēcijā un defekta mehāniskā aizvēršanā. Tiek uzskatīts, ka MPALC ir samazināta antigēna aktivitāte, jo in vitro kultivēšanas laikā tie zaudē Langerhansa šūnas, kas ļauj tiem ilgstoši pastāvēt recipienta organismā. Turklāt allogēnai kultūrai, kas iegūta no jaunu, veselīgu cilvēku ādas, ir nesalīdzināmi lielāks bioloģiskais potenciāls nekā autologai pacientu kultūrai pēc traumas.

Mūsu pētījuma galvenais mērķis bija noskaidrot, vai allogēnie keratinocīti iesakņosies rētās un kādas izmaiņas notiks rētaudos šāda bioloģiski aktīva "brūču pārklājuma" ietekmē. Pozitīva rezultāta gadījumā izstrādāt visefektīvāko un vismazāk darbietilpīgo tehnoloģiju šai rehabilitācijas medicīnas jomai.

Iegūtie dati daudzējādā ziņā bija līdzīgi literatūras datiem par morfoloģiskajām izmaiņām cilvēka epidermā pēc allogēnu keratinocītu transplantācijas apdegumu brūcēs. Tomēr pastāv arī būtiskas atšķirības gan morfoloģiskā substrāta, uz kura notiek transplantācija, gan tehnoloģijas ziņā. Tādējādi bazālās membrānas un dermas-epidermas savienojumu (hemidesmosomu, kārniņu) veidošanās process notiek vēlākā stadijā, salīdzinot ar keratinocītu transplantāciju uz brūču virsmām bez rētu izmaiņām. Acīmredzot tas notiek rētaudu sliktākas barošanās dēļ, salīdzinot ar dermu vai muskuļu fasciju. Rēta, īpaši veca, ir blīvi saistaudi ar ļoti mazu asinsvadu skaitu, savukārt apdegumu brūces apakšā ir asinsvadiem bagāti granulācijas audi. Tādējādi ir acīmredzams, ka apstākļi, kādos notiek keratinocītu transplantācija un iesakņošanās, ir absolūti atšķirīgi. Jo vairāk vaskularizēta ir šūnu transplantācijas zona, jo vieglāks ir to iesakņošanās process. No šī postulāta izriet secinājums par priekšroka darbam ar jaunām rētām, kurās saistaudi joprojām ir diezgan irdeni un bagāti ar asinsvadiem.

Šī eksperimentālā darba rezultātā tika pierādīts, ka:

1. MPALK transplantācija uz rētām ir iespējama.
2. Optimālā transplantācijas metode ir keratinocītu transplantācija uz brūces pārklājuma.
3. Rētas virsma jānoslīpē, izmantojot ķirurģisko lāzerdermabrāziju vai Šūmaņa griezēju.
4. MPALK ietekmē notiek rētas pulētās virsmas strauja epitelizācija.
5. Jo labāk vaskularizēti rētaudi, tas ir, jo jaunāka rēta, jo labāki ir keratinocītu transplantācijas rezultāti.
6. Transplantēto keratinocītu ietekmē rētaudi pakāpeniski pārveidojas un pārvēršas dermā līdzīgos (vairāk irdenos rētaudi ar ādas piedēkļiem).
7. Pakāpeniska rētaudu atslābšana, sākot ar subepidermālo slāni. Uzlabojas to vaskularizācija, kolagēna šķiedru kūlīši rētas augšējā un apakšējā daļā ieņem brīvāku izvietojumu nekā rētaudos bez šūnu transplantācijas. Parādās matu folikuli un tauku dziedzeri. Epiderma savā struktūrā, pārvarējusi hipertrofijas fāzi, tuvojas normālas ādas epidermai.
8. Novērotās izmaiņas ir saistītas ar keratinocītu izdalītajiem augšanas faktoriem un citokīniem, kas, uzlabojot rētaudu trofiku, veicina to pārveidošanos no rupjiem šķiedrainiem audiem par irdenākiem audiem, kas noved pie rētas izskata uzlabošanās.

Tādējādi, pamatojoties uz šo pētījumu, var secināt, ka transplantētajiem keratinocītiem ir labvēlīga ietekme uz rētaudiem, kam var būt praktiska nozīme pacientu ar dažāda veida rētām rehabilitācijā.

Šis darbs ar žurkām ļāva mums arī formulēt prasības brūču pārklājiem, uz kuriem audzē keratinocītus.

Brūču pārsējiem jābūt:

• bioloģiski saderīgs ar šūnām,
• elpojošs,
• ir elastīga, formu veidojoša pamatne,
• būt hidrofilam,
• kā zāļu piedevas satur antibakteriālas zāles un antioksidantus, kas nav toksiski kultivētām šūnām.

Rētu biotehnoloģiskās ārstēšanas klīniskie rezultāti.

Iepriekš N. Kārvers un līdzautori (1993) atklāja, ka okluzīvie pārsēji vislabāk veicina piestiprināšanos pie brūces un keratinocītu izdzīvošanu, bet neļauj veidoties stratificētai (nobriedušai) epidermai. Stratificētas epidermas veidošanai ir nepieciešama gaisa vide. Tāpēc pēc daudzslāņu slāņa piestiprināšanas tika ierosināts pēc 7–10 dienām noņemt okluzīvo brūces pārsēju un apstrādāt brūces ar sausiem pārsējiem vai ūdenī šķīstošām ziedēm. Var teikt, ka "substrāta", uz kura audzē šūnas, kvalitāte un īpašības ir ļoti svarīgs punkts šūnu materiāla transplantācijas efektivitātei un līdz ar to arī ārstu darba rezultātiem. Taču mūsdienās nav ideāla brūču pārsēja, neskatoties uz piedāvāto iespēju pārpilnību (mākslīgā āda, neausts audums, kas izgatavots no karboksimetilcelulozes, fibrīna pārklājumi, puscaurlaidīgas poliuretāna plēves). Svarīgs punkts šajā jautājumā ir "substrātu" (īpašu brūču pārklājumu) izmaksas, jo to augstās izmaksas palielina biotehnoloģiskās ārstēšanas kopējās izmaksas.

Šūnu tehnoloģiju efektivitāte ir pierādīta līdz šim, taču diemžēl šīs tehnoloģijas ir ļoti dārgas, īpaši valstīs, kur nav izveidota šūnu sastāvu rūpnieciskā ražošana. Tomēr tādas valstis kā Amerikas Savienotās Valstis jau sen ir izveidojušas rūpniecību šūnu materiāla ražošanai apdegumu transplantācijai. Jo īpaši uzņēmums BioSurface Technology Inc. kopš 1989. gada ir izaudzējis 37 000 daudzslāņu keratinocītu slāņu, kas tika izmantoti 240 pacientu ārstēšanai 79 pasaules valstīs (R. Odessey, 1992), savukārt 1 cm2 ^šūnu kultūras maksā aptuveni 7–8 ASV dolārus.

Dažādu ādas slimību un problēmu ārstēšanas tehnoloģijai ir vairākas atšķirības, taču jebkura šūnu ārstēšana balstās uz augstas kvalitātes šūnu materiāla iegūšanu un tā transplantāciju.

Šis process sastāv no šādiem soļiem:

• ādas ņemšana no upuriem (vai no donoriem),
• ādas atloku transportēšana uz biotehnoloģijas centru,
• bazālā slāņa šūnu izolēšana un to proliferācija,
• daudzslāņu keratinocītu slāņu (MLK) augšana.
• šūnu kultūras transplantācija.

Galvenā problēma, veicot ārstēšanu, izmantojot daudzslāņu keratinocītu lokšņu transplantāciju, ir dzīvotspējīgu šūnu nepieciešamība visos šūnu transplantācijas posmos. Ādas gabaliņiem autologu vai allogēnu šūnu izolēšanai jābūt pēc iespējas plānākiem, jo šajā gadījumā tos ir vieglāk atdalīt, izmantojot mehāniskas un fermentatīvas metodes, un iegūt dzīvu šūnu suspensiju kultivēšanai. Tos var iegūt, griežot ar dermatomu vai izmantojot plakstiņu, priekšādiņas un pleca iekšējās virsmas ādu. Ņemot vērā, ka šūnas ir jutīgas pret halogēniem (hloru, jodu), ūdeņraža peroksīdu, tās nevar izmantot ādas apstrādē materiāla savākšanas laikā.

Šūnu kvantitatīvā un kvalitatīvā raža no ādas transplantātiem un to kultivēšanas efektivitāte ir atkarīga arī no donora veselības stāvokļa un vecuma. Turklāt ādas biopsijas pēc iespējas ātrāk un atbilstošos apstākļos (vide, temperatūra) jānogādā uz šiem mērķiem sertificētu un akreditētu laboratoriju.

Ādas atloku uzglabāšanai un transportēšanai var izmantot Īgla barotni vai barotni 199 ar 10% liellopu seruma piedevu, DMEM barotni ar 5% augļa liellopu seruma piedevu un antibiotikas.

Citoloģijas laboratorijā ādas biopsija vispirms tiek mehāniski sadalīta mazos gabaliņos, pēc tam ādas gabaliņi tiek apstrādāti, izmantojot enzīmus: tripsīnu, kolagenāzi, dispāzi utt.

Enzīmu iedarbībā desmosomas tiek iznīcinātas, un keratinocīti tiek atbrīvoti vidē atsevišķu šūnu vai agregātu veidā, kas sastāv no dažāda skaita šūnu. Kultivēšanai tiek izmantoti tikai bazālie keratinocītu, kurus audzē uz speciālām vidēm termostatos, kas satur 5% CO2, Petri trauciņos vai kolbās t = 37 °C temperatūrā. Jau pēc 48 stundām tiek novērota keratinocītu koloniju veidošanās, kas pakāpeniski saplūst, pārvēršoties monoslānī. Pēc pietiekama šūnu skaita saņemšanas iegūto suspensiju sēj uz šim nolūkam sagatavotiem brūču pārsējiem un ievieto Petri trauciņos. Vispirms no suspensijas veidojas keratinocītu monoslānis un pēc tam daudzslāņu slānis. Keratinocītu kultivēšanas procesa posmi shematiski parādīti 12. attēlā (33,43,54,65).

Daudzslāņu keratinocītu slāņa, kas piemērots transplantācijai, veidošanās parasti ilgst 7–10 dienas. Dažreiz šis periods ir ilgāks, kas ir atkarīgs no izejmateriāla kvalitātes (donora vecuma, veselības stāvokļa, materiāla savākšanas pareizības, izmantotās barotnes kvalitātes utt.). Ja daudzslāņu slānis pāraug, uz tā virsmas var parādīties šūnas ar apoptozes parādībām, kas nav piemērotas transplantācijai. Petri trauciņi ar tajos uz brūču pārklājiem audzētiem daudzslāņu keratinocītu slāņiem (MLK) tiek nogādāti klīnikā īpašos konteineros vismaz +15° C temperatūrā.

Modificēta Grīna metode MPC audzēšanai

Savā darbā mēs izmantojām daudzslāņu kambriku kā brūču pārsēju, atsakoties no "Polypor" plēvēm, ar kurām sākām strādāt eksperimentā ar žurkām. Tādējādi mēs izaudzējām daudzslāņu keratinocītu slāņus uz iepriekš attaukota un sterila kambrika, lai gan tas arī nav optimāls brūču pārsējs.

Klīniskie pētījumi tika veikti ar brīvprātīgajiem, ievērojot nepieciešamos ētikas standartus: līguma parakstīšanu un informētu piekrišanu.

1. Tika izmantota pacienta paša (autologu) un uzkrātu (alogēnu) keratinocītu kultūra.
2. Pacientu pašu keratinocīti tika iegūti no ādas gabala, kas nogriezts no augšdelmu iekšpuses.
3. Rētu dermabrāzijas operācija tika veikta, izmantojot termokauteriju, rotējošos diskus un erbija lāzeru.
4. Tika ņemtas pacientu grupas ar normotrofiskām, hipotrofiskām un hipertrofiskām rētām.

Šūnu tehnoloģijas pielietošanas tehnoloģiskais process ādas rētu izskata uzlabošanai sastāvēja no šādiem posmiem:

1. Pacientu atlase.
2. Ārstēšanas būtības skaidrojumi, paredzamo rezultātu sasniegšanas laika posms, līguma parakstīšana un informēta piekrišana.
3. Izrakstīt pacientiem 2-3 nedēļas pirms operācijas selmevit 1 tableti 3 reizes dienā, zinctheral 1 tableti 3 reizes dienā.
4. Ņemot 2,0 cm garu un 0,7–1,0 cm platu ādas gabalu no pleca iekšējās virsmas, augstu, gandrīz padušu apvidus apakšējā daļā, lai iegūtu autologus keratinocītus.
5. Gadījumos, kad pacienti atteicās no savu keratinocītu izolēšanas lineāras rētas iespējamības dēļ pleca iekšējā virsmā, šūnu materiāls tika ņemts no šūnu bankas (alogēnie keratinocīti).
6. Keratinocīti tika izolēti un audzēti laboratorijā, kas ir sertificēta šāda veida darbam.
7. Pēc pietiekama MPC daudzuma iegūšanas transplantācijai uz rētām klīnikā tika noteikta operācijas diena, kur materiāls tika atvests īpašos traukos Petri trauciņos.
8. Tika veikta rētas dermabrāzijas operācija, hemostāze, pulēto virsmu nomazgāja ar sterilu fizioloģisko šķīdumu, nosusināja, pēc tam MPC tika pārstādītas uz tās uz sterilām kambriskām "šūnām uz leju". Tas ir, šūnas, kas atradās MPC augšpusē, izrādījās zemākas, blakus pulētajai virsmai.
9. Virsū tika uzklāta sterila plēve, kas tika piestiprināta pie ādas ar elastīgu saiti vai elastīgu Omnifix plāksteri. Plēves vietā var izmantot indiferenču brūču pārsējus, kas satur silikonu, piemēram, Mepitel, Mepiform, silikona gēla loksnes.

Pēc 5–7 dienām plēve vai silikona pārklājums tiek noņemts. Līdz šim laikam visiem keratinocītiem vajadzētu būt uzrāpušies uz pulētās rētas un piestiprinātiem pie tās virsmas.

10. Zem plēves un silikona pārklājuma izveidotā mitrā vide to aktīvi veicina. Turpmāk uz rētas palikušo kambriku var piesūcināt ar kuriozīna vai hitīna želeju. Rezultātā otrajā dienā izveidojas blīva garoza, kuru pacienta ērtībām vislabāk nostiprināt ar elastīgu, elpojošu plāksteri, piemēram, Omnifix. Elpojošā garoza ļauj izveidojušajai epidermai diferencēties un pārvērsties par nobriedušu.

Atkarībā no rētas veida un slīpēšanas dziļuma, pārsējs tiek atgrūsts pēc 8–10 dienām. Šajā laikā epidermā ir par 30–40 % vairāk šūnu slāņu nekā normālā ādā. Bazālā membrāna nav izveidojusies. Sabiezinātās epidermas keratinocīti rētaudos izdala daudz bioloģiski aktīvu molekulu.

Biotehnoloģiskās rētu ārstēšanas panākumi lielā mērā ir atkarīgi no aprūpes metodes pēcoperācijas periodā. Šūnu kultūras ir "saudzīgs" brūču pārklāšanas veids, un agrīnās stadijās pēc transplantācijas IPC var viegli atdalīt no pamatā esošajiem audiem. Tāpēc pacientiem ieteicams uzmanīgi rīkoties ar rētu pēc operācijas. 8-9 mēnešus neberzēt un maigi apstrādāt ar aukstu vārītu ūdeni, lai izvairītos no plānās, jaunizveidotās epidermas, kurai nav ciešas saites ar pamatā esošajiem audiem, noplēšanas.

Piezīme.

Pirms operācijas un dermabrāzijas laikā ir pieļaujama halogenētu antiseptisku līdzekļu un oksidētāju (jodpirona, suliodpirona, jodinola, jodināta, hlorheksidīna, ūdeņraža peroksīda) lietošana, pirms šūnu transplantācijas - stingri kontrindicēta to citotoksiskās iedarbības dēļ. Metilēnzilais un briljantzaļais ir arī toksiski šūnām.

Lai izvairītos no infekcijas, īpaši strādājot ar hipertrofiskām rētām, ķirurģisko lauku var apstrādāt ar neomicīna sulfātu, polimiksīnu vai gentamicīnu. Tiem nav citotoksiskas ietekmes uz keratinocītiem.

Šādas ārstēšanas rezultātā tiek panākts trīskāršs efekts.

1. Rētas virsmas izlīdzināšana.
2. Virs tā izveidojas jauns normāla biezuma epidermas slānis.
3. Rētaudu pārveidošanās par dermas tipa audiem citokīnu, augšanas faktoru un citu bioloģiski aktīvu molekulu darbības dēļ, ko izdala transplantētās šūnas un stimulē tās keratinocīti, fibroblasti un makrofāgi.

Rēta kļūst mazāk pamanāma, elastīgāka, tajā parādās poras un vellusa matiņi, un pigmentāciju var atjaunot melanocītu klātbūtnes dēļ IPC.

Tomēr visi šie rētas pozitīvie aspekti nerodas nekavējoties. Šajā sakarā ir jābrīdina pacienti, ka rētaudu pārveidošanās process dermas audos notiek lēni, un optimālu šādas ārstēšanas rezultātu var sagaidīt ne agrāk kā pēc 10–14 mēnešiem. Tūlīt pēc pārsēju noraidīšanas pulētajām virsmām ir izteikta polihromija, jo spilgtāka, jo dziļāka pulēšana veikta. Vismazākais ādas bojājums tiek novērots, pulējot normotrofiskas rētas ar erbija lāzeru. Rētu un apkārtējās ādas krāsa atjaunojās 3 līdz 8 nedēļu laikā. Neskatoties uz šādiem piesardzības pasākumiem, dažreiz rodas pēcoperācijas hiperpigmentācija, kas var izzust pati no sevis dažu mēnešu laikā.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]