Herpes diagnoze

Herpes diagnostika balstās uz klasisko vīrusa izolēšanu jutīgās šūnu kultūrās, imunofluorescences un seroloģiskajām metodēm, kolposkopisko izmeklēšanu un modernu molekulārbioloģisko metožu (PCR, dot hibridizācija) izmantošanu, kas ļauj diagnosticēt visu herpes vīrusu grupu, tostarp HHV-6 un HHV-7 tipus.

Herpes infekcijas laboratoriskās diagnostikas metodes

Galvenās metodes, kuru mērķis ir izolēt HSV vai noteikt vīrusu daļiņas un/vai to sastāvdaļas	Palīgmetodes, kuru mērķis ir noteikt antivielas pret HSV cilvēka ķermeņa bioloģiskajos šķidrumos
HSV izolēšana jutīgās šūnu un dzīvnieku kultūrās Tiešā un imūnelektronu mikroskopija IPA tiešie un netiešie varianti IFA Molekulārās bioloģijas metodes Lateksa aglutinācijas reakcija	Neitralizācijas reakcija RSC HSV-1,2 nestrukturālo proteīnu antivielu noteikšana

Tika pierādīts, ka 76% pacientu dzimumorgānu herpes (GH) izraisa HSV-2, bet 24% - HSV-1 tips. Turklāt GH kā monoinfekcija radās tikai 22% pacientu, 78% gadījumu tika atklātas mikrobu asociācijas. 46% indivīdu tika atklāta parazitocenoze, ko izraisa divi patogēni, tostarp hlamīdijas tika atklātas 40% gadījumu. Gardnerella, Trichomonas un gonokoki uztriepēs tika atklāti retāk.

27% pacientu parazitocenozi pārstāvēja trīs patogēni, 5,2% - četri patogēni. Turklāt visbiežāk tika atzīmēta hlamīdiju kombinācija ar gardnerellu un Candida sēnītēm. Šie dati pamato nepieciešamību pēc rūpīgas bakterioloģiskās izmeklēšanas pacientiem ar GH, lai identificētu patogēnu kombinācijas, kā arī padziļināta uroģenitālā trakta jaukto infekciju patogenēzes izpēte, kas ļaus veikt diferencētu kompleksu herpes infekcijas terapiju.

Materiāli, kas pētīti HSV izolēšanai atkarībā no herpetisku bojājumu lokalizācijas

Bojājumu lokalizācija	Vezikulu saturs	Šūnu nokasīšana				CSF	Bronhiālais aspirāts	Biopsija	Asinis
		1	2	3	4
Āda	+								+
Acis			+						+
Dzimumorgāni				+					+
Anālais atveres	+				+				+
Mute	+	+							+
CNS	+					+		+	+
Plaušas		+					+		+
Aknas								+	+
Iedzimts herpes	+	+	+				+		+

Citomegalovīrusa infekcijas laboratoriskās diagnostikas metodes

Metodes	Laiks, kas nepieciešams rezultātu iegūšanai	Piezīmes
VIROLOGISKI
Elektronu mikroskopija	3 stundas	Nav īpaši pieejams
Vīrusu izolēšana šūnu kultūrā (VCI)	4–20 dienas	Standarta, lēns
Agrīnās AG imunofluorescences krāsošana, izmantojot monoklonālās antivielas	6 stundas	Mazāk specifisks
CITOLOGISKS	2–3 stundas	Mazāk specifisks
SEROLOĢISKI
RSC	2 dienas	Standarta
RGA	1 diena	Darbietilpīgs
RIFS	6 stundas	Vienkāršs, konkrēts
NRIF	6 stundas	Grūti
RIMP	6 stundas	Grūti
ELISA (IgM, DO)	6 stundas	Ātri, vienkārši
Imunoblots	6 stundas	Dārgs
MOLEKULĀRĀ BIOLOĢISKAIS
MG	5–7 dienas	Dārgs, darbietilpīgs
PCR	3 stundas	Dārgs

Herpes zoster vīrusa diagnostikas metodes

Diagnostikas metodes	Laboratorijas metodes
NETIEŠI
Atlase	Audu kultūra, vistas embriji, laboratorijas dzīvnieki, kopkultūra ar permisīvām šūnām vai palīgvīrusiem
Izolātu identificēšana	Neitralizācijas reakcija, RSC, IF, PIEF, izolātu nogulsnēšanās reakcija, aglutinācija, IF
TIEŠI
Citoloģija	Uztriepes: krāsu imunofluorescence
Histoloģija	Šūnas patomorfoloģija
Struktūra	Embrionālā mikroskopija, imūnelektronu mikroskopija
Antigēnu noteikšana	JA, PIEF, RIM, IFA
Vietējās antivielu ražošanas noteikšana	Ig M, Ig G, Ig A: ELISA, RIA
Molekulārās bioloģijas pieejas	Molekulārā hibridizācija, PCR

Herpes zoster vīrusa izraisītas infekcijas laboratoriskā diagnostika

Diagnostikas problēmas	Metodes	Sagaidāmie rezultāti
Akūta primārā infekcija	1	Atklāšana 2 stundu laikā
	2	Antivielu līmenis lēnām paaugstinās
	3	Parādās 3 dienas pēc inficēšanās
Akūta reaktivēta infekcija	1	UUU noteikšana pēc 2 stundām
	2	Antivielu līmenis lēnām paaugstinās
	4	Parādās 4 dienas pēc izsitumu parādīšanās

1. VEGF pūslīšu noteikšana šķidrumā;
2. seroloģija: CSC, ELISA, paredzēta noteikšanai
3. seroloģija: ELISA, kuras mērķis ir IgM noteikšana;
4. seroloģija: ELISA, kuras mērķis ir noteikt IgA, IgM.

Metodes imūnās atbildes noteikšanai pret herpes zoster vīrusa infekciju

Pieeja	Metode
Antivielu titra palielināšanās noteikšana otrajā serumā	RSK, RTGA, RPGA, IF neitralizācijas reakcija, RIM, ELISA
Ig G, Ig A klases specifisko antivielu noteikšana pirmajā seruma paraugā	ELISA, IF, RIM, lateksa aglutinācija

Pacientu serumu seroloģiskās izmeklēšanas rezultātu interpretācija attiecībā uz herpesvīrusu infekcijām (ELISA)

Infekcijas/marķiera nosaukums	Infekciju vidējās robežvērtības
	Analīzes rezultāti	Interpretācija
Citomegālijas anti-CMV IgG (1–20 U/ml) Anti-CMV IgM (100–300%)	Pozitīvs 1–6 Pozitīvs 6–10 Pozitīvs >10 Negatīvs Pozitīvs 100–300 Negatīvs <90 Apšaubāms 90–100	Remisija Slimības saasināšanās Slimības akūtā fāze Nav infekcijas (slimības) Slimības akūtā fāze Atkārtojiet analīzi pēc 2-3 nedēļām
Herpes simplex 1, 2 serotipi Anti-HSV 1/2 kopā (100–900%)	Pozitīvs 100–400 Pozitīvs 400–800 Pozitīvs >800 Negatīvs <100	Remisija Slimības saasināšanās Akūta slimības fāze Nav infekcijas (slimības)

Tabulā ir sniegtas galvenās herpesvīrusu infekciju laboratoriskās diagnostikas metodes, kā arī ieteicamie bioloģiskie materiāli, kas tiek pārbaudīti, izolējot HSV, ņemot vērā herpes bojājumu lokalizāciju.

Uzticama herpes simplex un CMV vīrusu izolēšana, inficējot jutīgas šūnu kultūras. Tādējādi 26 pacientu virusoloģiskās izmeklēšanas laikā recidīva periodā HSV tika izolēts uz jutīgas Vero šūnu kultūras 23 gadījumos (88,4%). Inficētajās kultūrās bija novērojama HSV raksturīga citopātiska iedarbība - daudzkodolu milzu šūnu veidošanās vai apaļu un palielinātu šūnu uzkrāšanās klasteru veidā. 52,1% gadījumu vīrusa citopātiskas iedarbības perēkļus varēja noteikt jau 16-24 stundas pēc inficēšanās. Pēc 48-72 inficēto kultūru inkubācijas stundām materiālu, kas izraisa specifisku šūnu destruktiju, procentuālais daudzums palielinājās līdz 87%. Un tikai 13% gadījumu pozitīvi rezultāti tika konstatēti 96 stundas vai vēlāk pēc inficēšanās vai atkārtotas pasāžas laikā.

Ģeneralizētas herpes infekcijas laboratoriskās diagnostikas metodes

Galvenās metodes, kuru mērķis ir atklāt (izolēt) herpes vīrusus, to daļiņas un to sastāvdaļas	Palīgmetodes, kuru mērķis ir noteikt antivielas pret herpes vīrusiem bioloģiskajos šķidrumos, noteikt fermentatīvas nobīdes asins serumā
Herpes vīrusu izolēšana jutīgās šūnu un dzīvnieku kultūrās. Tiešā un imūnā elektronu mikroskopija. Imunoperoksidāzes metodes tiešie un netiešie varianti. Fluorescences antivielu metodes tiešie un netiešie varianti. Cietfāzes enzīmu imūnanalīzes varianti. Molekulārās (DNS-DNS) hibridizācijas metodes varianti. Polimerāzes ķēdes reakcija. Lateksa aglutinācijas reakcija.	Neitralizācijas tests Komplementa fiksācijas tests Lateksa aglutinācijas tests Fluorescējošo antivielu metodes netiešā versija Imunoperoksidāzes metodes netiešā versija Cietfāzes enzīmu imūnanalīzes varianti Imūnblotinga metode Radiālās komplementa fiksācijas metode Alanīna un aspartāta aminotransferāzes līmeņa noteikšana

Infekciozās mononukleozes (EBV izraisītas infekcijas) diagnosticēšanai izmanto seroloģiskās metodes. Pola-Bunela reakcija ar auna eritrocītiem, diagnostiskais titrs 1:28 vai augstāks vienā asins seruma testā vai 4 reizes lielāks antivielu līmenis, pārbaudot pāra serumus. Tiek izmantota Hofa-Bauera reakcija ar 4% formalizētu zirga eritrocītu suspensiju. Rezultāts tiek ņemts vērā pēc 2 minūtēm; infekciozās mononukleozes gadījumā reakcija ir ļoti specifiska.

Pašlaik tiek izstrādāta enzīmu imūnanalīzes (EIA) metode infekciozās mononukleozes diagnosticēšanai. Šajā gadījumā IgG un IgM antivielas pacienta serumā tiek noteiktas, inkubējot to ar limfoblastiem, kas inficēti ar EBV, un pēc tam apstrādājot ar fluorescējošām antivielām. Akūtā slimības periodā antivielas pret vīrusa kapsīda antigēnu tiek noteiktas titrā 1:160 un augstākā.

Izmantojot vairākas importētas komerciālas testa sistēmas, ELISA var noteikt: antivielas pret EBV apvalka antivielām, antivielas pret EBV agrīno antigēnu, kopējās antivielas pret EBV agrīno antigēnu, kas noteiktas slimības akūtā fāzē gan kodolā, gan šūnas citoplazmā, un ierobežotas antivielas pret EBV agrīno antigēnu, kas noteiktas slimības akūtā fāzē gan kodolā, gan šūnas citoplazmā, ierobežotas antivielas pret EBV agrīno antigēnu, kas noteiktas slimības kulminācijā tikai šūnas citoplazmā, un antivielas pret EBV kodola antigēnu. Šo testa sistēmu izmantošana ļauj diferenciāldiagnostiku vairākām ar EBV saistītām slimībām.

Pēc pozitīva ELISA testa, kas atklāj antivielas pret EBV, tiek veikta apstiprinoša imūnblotēšanas reakcija, kas nosaka antivielu klātbūtni pret atsevišķiem EBV marķieru proteīniem (p-proteīniem): p23, p54, p72 (šī proteīna klātbūtne norāda uz EBV reprodukcijas iespējamību), p 138. Iepriekš minētās laboratorijas metodes tiek izmantotas arī ārstēšanas efektivitātes uzraudzībai.

Viroloģisko metožu jutība ir 85–100%, specifiskums ir 100%, pētījuma laiks ir 2–5 dienas. Praktiskajā darbā bieži tiek izmantota tiešās imunofluorescences metode (DIF) ar poliklonālām vai monoklonālām antivielām pret HSV-1 un HSV-2. DIF metode ir diezgan viegli reproducējama parastā klīniskajā laboratorijā, nav dārga, jutība ir virs 80%, specifiskums ir 90–95%. Imūnfluorescences mikroskopija atklāja citoplazmas ieslēgumu klātbūtni, morfoloģiskās pazīmes, inficēto šūnu procentuālo daudzumu uztriepēs-nokasījumos no urīnizvadkanāla, dzemdes kakla kanāla, dzemdes kakla, taisnās zarnas.

PIF metode sniedz priekšstatu par šūnu morfoloģiskajām īpašībām un izmaiņām HSV antigēnu lokalizācijā. Papildus tiešām herpes vīrusu izraisītu šūnu bojājumu pazīmēm (specifiskas luminiscences noteikšana) pastāv arī netiešas herpes infekcijas pazīmes saskaņā ar PIF datiem:

• kodola vielas agregācija, kariolemmas atdalīšanās;
• tā saukto "caurumu" kodolu klātbūtne, kad no šūnas kodola paliek tikai viena kariolēma;
• intranukleāro ieslēgumu klātbūtne - Cowdry ķermeņi.

Veicot PIF, ārsts saņem ne tikai kvalitatīvu, bet arī kvantitatīvu inficēto šūnu stāvokļa novērtējumu, ko mēs izmantojām, lai novērtētu pretvīrusu terapijas ar acikloviru (AC) efektivitāti. Tādējādi, izmantojot PIF metodi, dinamikā tika pārbaudīti 80 pacienti ar vienkāršu dzimumorgānu herpes (GH). Tika parādīts, ka, ja pirms ārstēšanas ar acikloviru 88% pacientu uztriepēs bija augsts inficēto šūnu procentuālais daudzums (50-75% un vairāk), tad pēc viena aciklovira kursa veselas šūnas tika atklātas 44% pacientu uztriepēs, 31% gadījumu tika konstatētas atsevišķas inficētas šūnas, bet 25% pacientu bija līdz pat 10% inficētu šūnu.

Inficēto šūnu saturs uztriepēs (PIF reakcija) pacientiem ar dzimumorgānu herpes infekciju, kas ārstēti ar acikloviru

Slimības periodi	Procentuālais saturs uztriepēs
	Inficētās šūnas					Normālas šūnas
	Vairāk nekā 75%	50–75%	40–50%	10%	Atsevišķas šūnas redzes laukā
Recidīvs (pirms ārstēšanas)	25%	63%	12%
	(20)	(50)	(10)
Remisija (pēc ārstēšanas)				25%	31%	44%
				(20)	(25)	(35)

Daudzus gadus izmantojot PIF un punktu hibridizācijas metodi, ir atzīmēts, ka pētījuma rezultāti gandrīz 100% gadījumu sakrīt. Jāatzīmē, ka, lai palielinātu herpes diagnozes ticamību, īpaši subklīnisku un viegli izteiktu herpes formu gadījumos, darbā ieteicams izmantot 2–3 laboratoriskās diagnostikas metodes, īpaši izmeklējot grūtnieces, sievietes ar nelabvēlīgu dzemdību vēsturi un personas ar neprecizētu ginekoloģisko diagnozi.

Tādējādi uroģenitālā trakta vīrusu un bakteriālu infekciju PĶR diagnostikā ir jāizvērtē iegūtie pozitīvie rezultāti, ņemot vērā anamnēzi, specifisku slimības klīnisko simptomu klātbūtni (vai neesamību). Ja hlamīdijas tiek atklātas, izmantojot PĶR, tad šajā gadījumā pastāv liela infekcijas varbūtība, un terapijas jautājumi var tikt risināti atbilstoši. Mikoplazmu (ureaplazmu), kas ir oportūnistiski mikroorganismi, atklāšanas gadījumā diagnozes apstiprināšanai nepieciešami papildu kultūras pētījumi, t.i., pacienta materiāla sēšana uz jutīgām šūnu kultūrām. Tikai tad, ja kultūras analīzē tiek iegūti pozitīvi rezultāti, var runāt par mikoplazmozes diagnozes laboratorisku apstiprinājumu. Tā pati metode nepieciešamības gadījumā ļaus noteikt izolēto mikoplazmu jutību pret bieži lietojamām zāļu formām (antibiotikām, fluorhinoloniem utt.).

Iespējama vienlaicīga inficēšanās ar vairākiem Herpesviridae dzimtas vīrusiem. Bieži vien vienam pacientam konstatējām inficēšanos ar HSV-1, HSV-2 un CMV vīrusiem. Pacienti ar sekundāras IDS klīniskām un laboratoriskām izpausmēm (onkohematoloģiski, onkoloģiski, ar HIV inficēti pacienti) ievērojami biežāk inficējās ar vairākiem herpes vīrusiem. Tādējādi ir pierādīts, ka HIV infekcijas progresējošas klīniskās un imunoloģiskās slimības pavada ar molekulārās hibridizācijas metodes palīdzību atklāto herpes vīrusu skaita palielināšanās. Šajā gadījumā par prognostiski nozīmīgāko var uzskatīt HSV-1, CMV un HHV-6 tipa DNS komplekso vienlaicīgo noteikšanu.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]