Dzeltenuma maisiņa hematopoētiskās cilmes šūnas

Acīmredzot, hematopoētisko cilmes šūnu dažādos proliferācijas un diferenciācijas potenciālus nosaka to ontogēnetiskās attīstības īpatnības, jo pat galveno hematopoēzes apgabalu lokalizācija cilvēkiem ontoģenēzes laikā mainās. Augļa dzeltenuma maisiņa hematopoētiskās cilmes šūnas ir apņēmušās veidot tikai eritropoētisku šūnu līniju. Pēc primāro HSC migrācijas uz aknām un liesu šo orgānu mikrovidē paplašinās saistību līniju spektrs. Jo īpaši hematopoētiskās cilmes šūnas iegūst spēju ģenerēt limfoīdās cilmes šūnas. Prenatālajā periodā hematopoētiskās cilmes šūnas sasniedz galīgās lokalizācijas zonu un apdzīvo kaulu smadzenes. Intrauterīnās attīstības laikā augļa asinīs ir ievērojams skaits hematopoētisko cilmes šūnu. Piemēram, 13. grūtniecības nedēļā HSC līmenis sasniedz 18% no kopējā mononukleāro asins šūnu skaita. Pēc tam tiek novērota pakāpeniska to satura samazināšanās, bet pat pirms dzimšanas HSC daudzums nabassaites asinīs maz atšķiras no to daudzuma kaulu smadzenēs.

Saskaņā ar klasiskajiem konceptiem dabiskās izmaiņas hematopoēzes lokalizācijā zīdītāju embrionālās attīstības laikā tiek veiktas, migrējot un ieviešot jaunā pluripotentu hematopoētisko cilmes šūnu mikrovidē - no dzeltenuma maisiņa līdz aknām, liesai un kaulu smadzenēm. Tā kā embrionālās attīstības sākumposmā hematopoētiskajos audos ir liels skaits cilmes šūnu, kas samazinās, auglim nobriestot, par perspektīvākajiem hematopoētisko cilmes šūnu iegūšanai tiek uzskatīti embrionālo aknu hematopoētiskie audi, kas izolēti no abortēta materiāla 5-8 grūtniecības nedēļās.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Jautājumi par hematopoētisko cilmes šūnu izcelsmi

Nav šaubu, ka embrionālo eritrocītu veidošanās sākas dzeltenuma maisiņa asins saliņās. Tomēr dzeltenuma maisiņa hematopoētisko šūnu diferenciācijas potenciāls in vitro ir ļoti ierobežots (tās diferencējas galvenokārt par eritrocītiem). Jāatzīmē, ka dzeltenuma maisiņa hematopoētisko cilmes šūnu transplantācija ilgstoši nespēj atjaunot hematopoēzi. Izrādījās, ka šīs šūnas nav pieaugušo HSC priekšteči. Īstas HSC parādās agrāk, 3.–5. intrauterīnās attīstības nedēļā, kuņģa audu un asinsvadu endotēlija veidošanās zonā (paraaortālā splanhnopleura, P-SP), kā arī aortas, dzimumdziedzeru un primāro nieru vietā – mezonefrozes jeb tā sauktajā AGM reģionā. Ir pierādīts, ka AGM reģiona šūnas ir ne tikai HSC, bet arī asinsvadu endotēlija šūnu, kā arī osteoklastu, kas iesaistīti kaulu audu veidošanās procesos, avots. 6. grūtniecības nedēļā agrīnās hematopoētiskās cilmes šūnas no AGM reģiona pārvietojas uz aknām, kas līdz dzimšanas brīdim paliek galvenais augļa hematopoētiskais orgāns.

Tā kā šis punkts ir ārkārtīgi svarīgs no šūnu transplantācijas viedokļa, HSC izcelsmes problēma cilvēka embriogenēzes procesā ir pelnījusi detalizētāku izklāstu. Klasiskās idejas, ka zīdītāju un putnu hematopoētiskās cilmes šūnas rodas no ekstraembrionāla avota, balstās uz Metkalfa un Mūra pētījumiem, kuri pirmie izmantoja HSC un to pēcnācēju klonēšanas metodes, kas izolēti no dzeltenuma maisiņa. Viņu darba rezultāti kalpoja par pamatu migrācijas teorijai, saskaņā ar kuru HSC, vispirms parādoties dzeltenuma maisiņā, secīgi apdzīvo pārejas un galīgos hematopoētiskos orgānus, jo tajos veidojas atbilstošā mikrovide. Tādā veidā tika izveidots viedoklis, ka HSC paaudze, kas sākotnēji lokalizēta dzeltenuma maisiņā, kalpo par šūnu pamatu galīgajai hematopoēzei.

Dzeltenuma maisiņa hematopoētiskās cilmes šūnas pieder pie agrāko hematopoētisko cilmes šūnu kategorijas. To fenotipu apraksta formula AA4.1+CD34+c-kit+. Atšķirībā no nobriedušām kaulu smadzeņu HSC, tās neizpauž Sca-1 antigēnus un MHC molekulas. Šķiet, ka marķieru antigēnu parādīšanās uz dzeltenuma maisiņa HSC virsmas membrānām kultivēšanas laikā atbilst to diferenciācijai embrionālās attīstības laikā, veidojoties specializētām hematopoētiskām līnijām: samazinās CD34 un Thy-1 antigēnu ekspresijas līmenis, palielinās CD38 un CD45RA ekspresija un parādās HLA-DR molekulas. Ar sekojošu specializāciju in vitro, ko izraisa citokīni un augšanas faktori, sākas noteiktas šūnu līnijas hematopoētiskajām cilmes šūnām specifisku antigēnu ekspresija. Tomēr embrionālās hematopoēzes pētījumu rezultāti trīs mugurkaulnieku klašu (abinieki, putni un zīdītāji) pārstāvjiem un jo īpaši HSC izcelsmes analīze, kas ir atbildīgas par galīgo hematopoēzi postnatālajā ontoģenēzē, ir pretrunā ar klasiskajiem priekšstatiem. Ir konstatēts, ka visu aplūkoto klašu pārstāvjiem embriogenēzes laikā veidojas divi neatkarīgi reģioni, kuros rodas HSC. Ekstraembrionālo “klasisko” reģionu pārstāv dzeltenuma maisiņš vai tā analogi, savukārt nesen identificētā HSC lokalizācijas intraembrionālā zona ietver paraaortālo mezenhīmu un AGM reģionu. Mūsdienās var apgalvot, ka abiniekiem un putniem galīgās HSC rodas no intraembrionāliem avotiem, savukārt zīdītājiem un cilvēkiem dzeltenuma maisiņa HSC līdzdalību galīgajā hematopoēzē vēl nevar pilnībā izslēgt.

Embrionālā hematopoēze dzeltenummaisā faktiski ir primārā eritropoēze, ko raksturo kodola saglabāšanās visos eritrocītu nobriešanas posmos un augļa tipa hemoglobīna sintēze. Saskaņā ar jaunākajiem datiem primārās eritropoēzes vilnis dzeltenummaisā beidzas embrionālās attīstības 8. dienā. Pēc tam seko definitīvo eritroīdo cilmes šūnu - BFU-E - uzkrāšanās periods, kas veidojas tikai dzeltenummaisā un pirmo reizi parādās 9. grūtniecības dienā. Nākamajā embriogenēzes posmā jau ir izveidojušās definitīvās eritroīdo cilmes šūnas - CFU-E, kā arī (!) tuklās šūnas un CFU-GM. Tas ir pamats uzskatam, ka definitīvās cilmes šūnas rodas dzeltenummaisā, migrē ar asinsriti, nosēžas aknās un ātri uzsāk intraembrionālās hematopoēzes pirmo fāzi. Saskaņā ar šiem jēdzieniem dzeltenuma maisiņu var uzskatīt, no vienas puses, par primārās eritropoēzes vietu, no otras puses, par pirmo galīgo hematopoētisko cilmes šūnu avotu embrionālajā attīstībā.

Ir pierādīts, ka koloniju veidojošās šūnas ar augstu proliferācijas potenciālu var izolēt no dzeltenuma maisiņa jau 8. grūtniecības dienā, t.i., ilgi pirms embrija un dzeltenuma maisiņa asinsvadu sistēmas slēgšanās. Turklāt šūnas ar augstu proliferācijas potenciālu, kas iegūtas no dzeltenuma maisiņa in vitro, veido kolonijas, kuru izmērs un šūnu sastāvs neatšķiras no atbilstošajiem kaulu smadzeņu cilmes šūnu kultūras augšanas parametriem. Tajā pašā laikā, atkārtoti transplantējot dzeltenuma maisiņa koloniju veidojošās šūnas ar augstu proliferācijas potenciālu, veidojas ievērojami vairāk meitu koloniju veidojošo šūnu un multipotentu cilmes šūnu nekā izmantojot hematopoēzes kaulu smadzeņu cilmes šūnas.

Galīgo secinājumu par dzeltenuma maisiņa hematopoētisko cilmes šūnu lomu galīgajā hematopoēzē varētu sniegt darba rezultāti, kurā autori ieguva dzeltenuma maisiņa endotēlija šūnu līniju (G166), kas efektīvi atbalstīja tās šūnu proliferāciju ar HSC fenotipiskajām un funkcionālajām īpašībām (AA4.1+WGA+, zems blīvums un vājas adhēzijas īpašības). Pēdējo saturs palielinājās vairāk nekā 100 reizes, kultivējot uz C166 šūnu barotnes slāņa 8 dienas. Jauktās kolonijās, kas audzētas uz C166 šūnu apakšslāņa, tika identificēti makrofāgi, granulocīti, megakariocīti, blastu šūnas un monocīti, kā arī B un T limfocītu prekursoru šūnas. Dzeltenuma maisiņa šūnām, kas auga uz endotēlija šūnu apakšslāņa, bija spēja pašvairoties un autoru eksperimentos tās izturēja līdz pat trim pārejām. Hematopoēzes atjaunošana ar to palīdzību nobriedušām pelēm ar smagu kombinētu imūndeficītu (SCID) notika kopā ar visu veidu leikocītu, kā arī T un B limfocītu veidošanos. Tomēr autori savos pētījumos izmantoja 10 dienu veca embrija dzeltenuma maisiņa šūnas, kurās ekstraembrionālā un intraembrionālā asinsvadu sistēma jau ir slēgta, kas neļauj izslēgt intraembrionālo HSC klātbūtni dzeltenuma maisiņa šūnās.

Vienlaikus, analizējot agrīnās attīstības stadijas hematopoētisko šūnu diferenciācijas potenciālu, kas izolētas pirms dzeltenuma maisiņa un embrija asinsvadu sistēmu apvienošanās (8–8,5 grūtniecības dienas), tika atklāta T un B šūnu prekursoru klātbūtne dzeltenuma maisiņā, bet ne embrija ķermenī. In vitro sistēmā, izmantojot divpakāpju kultivēšanas metodi uz aizkrūtes dziedzera epitēlija un subepitēlija šūnu monoslāņa, dzeltenuma maisiņa mononukleārās šūnas diferencējās pre-T un nobriedušos T limfocītos. Tādos pašos kultivēšanas apstākļos, bet uz aknu un kaulu smadzeņu stromas šūnu monoslāņa, dzeltenuma maisiņa mononukleārās šūnas diferencējās pre-B šūnās un nobriedušos IglVT-B limfocītos.

Šo pētījumu rezultāti norāda uz imūnsistēmas šūnu attīstības iespējamību no dzeltenuma maisiņa ekstraembrionālajiem audiem, un primāro T un B šūnu līniju veidošanās ir atkarīga no embrionālo hematopoētisko orgānu stromas mikrovides faktoriem.

Arī citi autori ir pierādījuši, ka dzeltenuma maisiņā ir šūnas ar limfoīdo diferenciācijas potenciālu, un iegūtie limfocīti pēc antigēnām īpašībām neatšķiras no seksuāli nobriedušu dzīvnieku limfocītiem. Ir noskaidrots, ka 8–9 dienas veca embrija dzeltenuma maisiņa šūnas spēj atjaunot limfopoēzi atimocītu aizkrūtes dziedzerī, parādoties nobriedušiem CD3+CD4+- un CD3+CD8+-limfocītiem, kuriem ir izveidojies T šūnu receptoru repertuārs. Tādējādi aizkrūtes dziedzeri var apdzīvot ar ekstraembrionālas izcelsmes šūnām, taču nav iespējams izslēgt agrīno T limfocītu prekursoru šūnu iespējamu migrāciju no intraembrionāliem limfopoēzes avotiem aizkrūtes dziedzerī.

Tajā pašā laikā dzeltenuma maisiņa hematopoētisko šūnu transplantācija pieaugušiem apstarotiem recipientiem ne vienmēr nodrošina ilgstošu noplicināto hematopoētisko audu lokalizācijas zonu repopulāciju, un in vitro dzeltenuma maisiņa šūnas veido ievērojami mazāk liesas koloniju nekā AGM reģiona šūnas. Dažos gadījumos, izmantojot 9 dienas veca embrija dzeltenuma maisiņa šūnas, joprojām ir iespējams panākt ilgstošu (līdz 6 mēnešiem) hematopoētisko audu repopulāciju apstarotiem recipientiem. Autori uzskata, ka dzeltenuma maisiņa šūnas ar CD34+c-kit+ fenotipu ne tikai neatšķiras no šūnām no AGM reģiona pēc spējas atjaunot noplicinātos hematopoētiskos orgānus, bet arī efektīvāk atjauno hematopoēzi, jo dzeltenuma maisiņā to ir gandrīz 37 reizes vairāk.

Jāatzīmē, ka eksperimentos tika izmantotas dzeltenuma maisiņa hematopoētiskās šūnas ar hematopoētisko cilmes šūnu marķierantigēniem (c-kit+ un/vai CD34+ un CD38+), kas tika injicētas tieši peļu mātīšu pēcnācēju aknās vai vēdera vēnā, kurām 18. grūtniecības dienā tika ievadīts busulfāns. Šādiem jaundzimušiem dzīvniekiem viņu pašu mielopoēze bija strauji nomākta busulfāna izraisītās hematopoētisko cilmes šūnu eliminācijas dēļ. Pēc dzeltenuma maisiņa hematopoētisko cilmes šūnu transplantācijas recipientu perifērajās asinīs 11 mēnešus tika konstatēti veidoti elementi, kas satur donora marķieri - glicerofosfāta dehidrogenāzi. Tika konstatēts, ka dzeltenuma maisiņa HSC atjauno limfoīdo, mieloīdo un eritroīdo cilmes šūnu saturu asinīs, aizkrūtes dziedzerī, liesā un kaulu smadzenēs, un himērisma līmenis bija augstāks dzeltenuma maisiņa šūnu intrahepatiskas, nevis intravenozas ievadīšanas gadījumā. Autori uzskata, ka agrīnās stadijas embriju (līdz 10 dienām) dzeltenuma maisiņa HSC ir nepieciešama iepriekšēja mijiedarbība ar aknu hematopoētisko mikrovidi, lai veiksmīgi apdzīvotu pieaugušu recipientu hematopoētiskos orgānus. Iespējams, ka embriogenēzē ir unikāls attīstības posms, kad dzeltenuma maisiņa šūnas, sākotnēji migrējot uz aknām, pēc tam iegūst spēju apdzīvot nobriedušu recipientu hematopoētisko orgānu stromu.

Šajā sakarā jāatzīmē, ka imūnsistēmas šūnu himērisms diezgan bieži tiek novērots pēc kaulu smadzeņu šūnu transplantācijas apstarotiem nobriedušiem recipientiem - pēdējo asinīs donora fenotipa šūnas ir atrodamas diezgan lielā daudzumā starp recipienta B-, T-limfocītiem un granulocītiem, kas turpinās vismaz 6 mēnešus.

Zīdītāju hematopoētiskās šūnas pirmo reizi tiek atklātas ar morfoloģiskām metodēm 7. embrionālās attīstības dienā, un tās attēlo hematopoētiskās salas dzeltenuma maisiņa traukos. Tomēr dabiskā hematopoētiskā diferenciācija dzeltenuma maisiņā aprobežojas ar primārajiem eritrocītiem, kas saglabā kodolus un sintezē augļa hemoglobīnu. Neskatoties uz to, tradicionāli tika uzskatīts, ka dzeltenuma maisiņš kalpo kā vienīgais HSC avots, kas migrē uz attīstošā embrija hematopoētiskajiem orgāniem un nodrošina galīgo hematopoēzi pieaugušiem dzīvniekiem, jo HSC parādīšanās embrija ķermenī sakrīt ar dzeltenuma maisiņa un embrija asinsvadu sistēmu slēgšanos. Šo viedokli apstiprina dati, ka dzeltenuma maisiņa šūnas, klonējot in vitro, rada granulocītus un makrofāgus, bet in vivo - liesas kolonijas. Pēc tam transplantācijas eksperimentu gaitā tika konstatēts, ka dzeltenuma maisiņa hematopoētiskās šūnas, kas pašā dzeltenuma maisiņā spēj diferencēties tikai primārajos eritrocītos, jaundzimušo un pieaugušu SCID peļu aknu mikrovidē, noplicinātajā aizkrūtes dziedzerī vai stromas barotavā, iegūst spēju atjaunot hematopoētiskos orgānus, atjaunojot visas hematopoētiskās līnijas pat pieaugušiem recipientdzīvniekiem. Principā tas ļauj tās klasificēt kā īstas HSC - kā šūnas, kas darbojas pēcdzemdību periodā. Tiek pieņemts, ka dzeltenuma maisiņš kopā ar AGM reģionu kalpo kā HSC avots galīgai hematopoēzei zīdītājiem, taču to ieguldījums hematopoētiskās sistēmas attīstībā joprojām nav skaidrs. Arī divu hematopoētisko orgānu ar līdzīgām funkcijām esamības bioloģiskā nozīme agrīnā zīdītāju embrioģenēzē nav skaidra.

Atbilžu meklējumi uz šiem jautājumiem turpinās. In vivo bija iespējams pierādīt limfopoēzi atjaunojošu šūnu klātbūtni 8–8,5 dienas vecu embriju dzeltenuma maisiņā subletāli apstarotām SCID pelēm ar izteiktu T un B limfocītu deficītu. Dzeltenuma maisiņa hematopoētiskās šūnas tika injicētas gan intraperitoneāli, gan tieši liesā un aknu audos. Pēc 16 nedēļām recipientiem tika atklāti TCR/CD34 CD4+ un CD8+ T limfocīti un B-220+IgM+ B limfocīti, kas iezīmēti ar donora MHC antrxgēniem. Tajā pašā laikā autori neatrada cilmes šūnas, kas spētu atjaunot imūnsistēmu 8–8,5 dienas vecu embriju organismā.

Dzeltenuma maisiņa hematopoētiskajām šūnām ir augsts proliferācijas potenciāls, un tās spēj ilgstoši pašvairoties in vitro. Daži autori identificē šīs šūnas kā HSC, pamatojoties uz ilgstošu (gandrīz 7 mēnešus) eritroīdo cilmes šūnu veidošanos, kas atšķiras no eritroīdās līnijas kaulu smadzeņu cilmes šūnām ar ilgāku pasāžas periodu, lielākiem koloniju izmēriem, paaugstinātu jutību pret augšanas faktoriem un ilgāku proliferāciju. Turklāt atbilstošos dzeltenuma maisiņa šūnu kultivēšanas apstākļos in vitro veidojas arī limfoīdās cilmes šūnas.

Iesniegtie dati kopumā ļauj mums uzskatīt dzeltenuma maisiņu par HSC avotu, kas ir mazāk iesaistīti un tāpēc tiem ir lielāks proliferācijas potenciāls nekā kaulu smadzeņu cilmes šūnām. Tomēr, neskatoties uz to, ka dzeltenuma maisiņš satur pluripotentas hematopoētiskās cilmes šūnas, kas in vitro ilgstoši uztur dažādas hematopoētiskās diferenciācijas līnijas, vienīgais HSC pilnīguma kritērijs ir to spēja ilgtermiņā atjaunot recipienta hematopoētiskos orgānus, kuru hematopoētiskās šūnas ir iznīcinātas vai ģenētiski bojātas. Tādējādi galvenais jautājums ir, vai dzeltenuma maisiņa pluripotentās hematopoētiskās šūnas var migrēt un atjaunot hematopoētiskos orgānus, un vai ir ieteicams pārskatīt zināmos darbus, kas pierāda to spēju atjaunot nobriedušu dzīvnieku hematopoētiskos orgānus, veidojot galvenās hematopoētiskās līnijas. Jau 20. gadsimta 70. gados putnu embrijos tika identificēti galīgo GSC intraembrionālie avoti, kas jau toreiz radīja šaubas par iedibinātajām idejām par GSC ekstraembrionālo izcelsmi, tostarp citu mugurkaulnieku klašu pārstāvjos. Pēdējos gados ir parādījušās publikācijas par līdzīgu intraembrionālu apgabalu, kas satur GSC, klātbūtni zīdītājiem un cilvēkiem.

Vēlreiz jāatzīmē, ka fundamentālas zināšanas šajā jomā ir ārkārtīgi svarīgas praktiskajai šūnu transplantācijai, jo tās palīdzēs ne tikai noteikt vēlamo HSC avotu, bet arī noteikt primāro hematopoētisko šūnu mijiedarbības iezīmes ar ģenētiski svešu organismu. Ir zināms, ka cilvēka augļa aknu hematopoētisko cilmes šūnu ievadīšana aitas embrijā organoģenēzes stadijā noved pie himēru dzīvnieku dzimšanas, kuru asinīs un kaulu smadzenēs stabili tiek noteikti 3 līdz 5% cilvēka hematopoētisko šūnu. Tajā pašā laikā cilvēka HSC nemaina savu kariotipu, saglabājot augstu proliferācijas ātrumu un spēju diferencēties. Turklāt transplantētās ksenogēnās HSC nekonfliktē ar saimniekorganisma imūnsistēmu un fagocītiem un nepārvēršas audzēja šūnās, kas veidoja pamatu intensīvai iedzimtas ģenētiskas patoloģijas intrauterīnas korekcijas metožu izstrādei, izmantojot HSC vai ESC, kas transfektētas ar deficītiem gēniem.

Bet kurā embriogenēzes stadijā ir piemērotāk veikt šādu korekciju? Pirmo reizi šūnas, kurām noteikta hematopoēze, zīdītājiem parādās tūlīt pēc implantācijas (6. grūtniecības dienā), kad vēl nav hematopoētiskās diferenciācijas un iespējamo hematopoētisko orgānu morfoloģisko pazīmju. Šajā posmā izkliedētās peles embrija šūnas spēj atjaunot apstaroto recipientu hematopoētiskos orgānus, veidojot eritrocītus un limfocītus, kas no saimniekšūnām atšķiras attiecīgi ar hemoglobīna vai glicerofosfāta izomerāzes veidu, kā arī ar donoru šūnu papildu hromosomu marķieri (Tb). Zīdītājiem, tāpat kā putniem, vienlaikus ar dzeltenuma maisiņu, pirms kopējās asinsvadu gultnes slēgšanas, hematopoētiskās šūnas parādās tieši embrija ķermenī paraaortālajā splanhnopleurā. No AGM reģiona tika izolētas AA4.1+ fenotipa hematopoētiskās šūnas un raksturotas kā multipotentas hematopoētiskās šūnas, kas veido T- un B-limfocītus, granulocītus, megakariocītus un makrofāgus. Fenotipiski šīs multipotentās cilmes šūnas ir ļoti tuvas pieaugušu dzīvnieku kaulu smadzeņu HSC (CD34+c-kit+). Multipotento AA4.1+ šūnu skaits starp visām AGM reģiona šūnām ir neliels – tās veido ne vairāk kā 1/12 no tā daļas.

Cilvēka embrijā ir identificēts arī intraembrionāls reģions, kas satur HSC, kas ir homologas dzīvnieku AGM reģionam. Turklāt cilvēkiem vairāk nekā 80% multipotentu šūnu ar augstu proliferācijas potenciālu atrodas embrija ķermenī, lai gan šādas šūnas atrodas arī dzeltenuma maisiņā. Detalizēta to lokalizācijas analīze parādīja, ka simtiem šādu šūnu ir savāktas kompaktās grupās, kas atrodas tiešā tuvumā dorsālās aortas ventrālās sienas endotēlijam. Fenotipiski tās ir CD34CD45+Lin šūnas. Gluži pretēji, dzeltenuma maisiņā, kā arī citos embrija asinsrades orgānos (aknās, kaulu smadzenēs) šādas šūnas ir atsevišķas.

Līdz ar to cilvēka embrijā AGM reģionā ir hematopoētisko šūnu kopas, kas ir cieši saistītas ar dorsālās aortas ventrālo endotēliju. Šis kontakts ir izsekojams arī imūnķīmiskajā līmenī - gan hematopoētisko kopu šūnas, gan endotēlija šūnas ekspresē asinsvadu endotēlija augšanas faktoru, Flt-3 ligandu, to receptorus FLK-1 un STK-1, kā arī leikēmijas cilmes šūnu transkripcijas faktoru. AGM reģionā mezenhimālos atvasinājumus pārstāv blīva noapaļotu šūnu virkne, kas atrodas gar visu dorsālo aortu un ekspresē tenascīnu C - pamatvielas glikoproteīnu, kas aktīvi piedalās starpšūnu mijiedarbības un migrācijas procesos.

AGM reģiona multipotentās cilmes šūnas pēc transplantācijas ātri atjauno hematopoēzi nobriedušām apstarotām pelēm un nodrošina efektīvu hematopoēzi ilgu laiku (līdz 8 mēnešiem). Autori dzeltenuma maisiņā neatrada šūnas ar šādām īpašībām. Šī pētījuma rezultātus apstiprina cita darba dati, kas parādīja, ka agrīnās attīstības stadijas (10,5 dienas) embrijos AGM reģions ir vienīgais šūnu avots, kas atbilst HSC definīcijai, atjaunojot mieloīdo un limfoīdo hematopoēzi nobriedušiem apstarotiem recipientiem.

No AGM reģiona tika izolēta stromas līnija AGM-S3, kuras šūnas atbalsta specializētu cilmes šūnu CFU-GM, BFU-E, CFU-E un jaukta tipa koloniju veidojošo vienību veidošanos kultūrā. Pēdējo saturs kultivēšanas laikā uz AGM-S3 līnijas šūnu barotavas apakšslāņa palielinās no 10 līdz 80 reizēm. Tādējādi AGM reģiona mikrovidē ir stromas bāzes šūnas, kas efektīvi atbalsta hematopoēzi, tāpēc pats AGM reģions var labi darboties kā embrionāls hematopoētiskais orgāns - galīgo HSC avots, tas ir, HSC, kas veido pieauguša dzīvnieka hematopoētiskos audus.

Paplašināta AGM reģiona šūnu sastāva imunofenotipa noteikšana parādīja, ka tas satur ne tikai multipotentas hematopoētiskās šūnas, bet arī šūnas, kas paredzētas mieloīdo un limfoīdo (T un B limfocītu) diferenciācijai. Tomēr atsevišķu CD34+c-kit+ šūnu molekulārā analīze no AGM reģiona, izmantojot polimerāzes ķēdes reakciju, atklāja tikai beta-globīna un mieloperoksidāzes gēnu aktivāciju, bet ne limfoīdo gēnu, kas kodē CD34, Thy-1 un 15 sintēzi, aktivāciju. Līnijai specifisku gēnu daļēja aktivācija ir raksturīga HSC un cilmes šūnu ģenerēšanas agrīnajām ontoģenēzes stadijām. Ņemot vērā, ka 10 dienu embrija AGM reģionā iesaistīto cilmes šūnu skaits ir par 2-3 lieluma kārtām mazāks nekā aknās, var apgalvot, ka embrioģenēzes 10. dienā hematopoēze AGM reģionā tikai sākas, savukārt augļa galvenajā hematopoētiskajā orgānā šajā periodā hematopoētiskās līnijas jau ir attīstījušās.

Patiešām, atšķirībā no agrākām (9–11 dienu) dzeltenuma maisiņa un AGM reģiona hematopoētiskajām cilmes šūnām, kas atjauno jaundzimušā, bet ne pieaugušā organisma hematopoētisko mikrovidi, 12–17 dienu embrionālo aknu hematopoētiskajām cilmes šūnām vairs nav nepieciešama agrīna pēcdzemdību mikrovide, un tās apdzīvo pieauguša dzīvnieka hematopoētiskos orgānus ne sliktāk kā jaundzimušajam. Pēc embrionālo aknu HSC transplantācijas hematopoēzei apstarotām pieaugušām recipientpelēm bija poliklonāls raksturs. Turklāt, izmantojot iezīmētas kolonijas, tika pierādīts, ka engrafēto klonu darbība ir pilnībā pakļauta klonu sukcesijai, kas atklāta pieaugušo kaulu smadzenēs. Līdz ar to embrionālās aknu HSC, kas iezīmētas vismaigākajos apstākļos, bez iepriekšējas stimulācijas ar eksogēniem citokīniem, jau piemīt galvenās pieaugušo HSC īpašības: tām nav nepieciešama agrīna pēcembrionāla mikrovide, pēc transplantācijas tās nonāk dziļa miera stāvoklī un secīgi tiek mobilizētas klonu veidošanā saskaņā ar klonu sukcesijas modeli.

Acīmredzot ir nepieciešams sīkāk aplūkot klonālās sukcesijas fenomenu. Eritropoēzi veic hematopoētiskās cilmes šūnas, kurām ir augsts proliferācijas potenciāls un spēja diferencēties visās specializētajās asins šūnu prekursoru šūnu līnijās. Normālas hematopoēzes intensitātes gadījumā lielākā daļa hematopoētisko cilmes šūnu atrodas neaktīvā stāvoklī un tiek mobilizētas proliferācijai un diferenciācijai, secīgi veidojot klonus, kas aizstāj viens otru. Šo procesu sauc par klonālo sukcesiju. Eksperimentāli pierādījumi par klonālo sukcesiju hematopoētiskajā sistēmā tika iegūti pētījumos ar HSC, ko iezīmēja retrovīrusu gēnu pārnese. Pieaugušiem dzīvniekiem hematopoēzi uztur daudzi vienlaicīgi funkcionējoši hematopoētiskie kloni, HSC atvasinājumi. Pamatojoties uz klonālās sukcesijas fenomenu, ir izstrādāta repopulācijas pieeja HSC identificēšanai. Saskaņā ar šo principu tiek nošķirtas ilgtermiņa hematopoētiskās cilmes šūnas (LT-HSC), kas spēj atjaunot hematopoētisko sistēmu visu mūžu, un īstermiņa HSC, kas šo funkciju veic ierobežotu laika periodu.

Ja mēs aplūkojam hematopoētiskās cilmes šūnas no repopulācijas pieejas viedokļa, tad embrionālo aknu hematopoētisko šūnu īpatnība ir to spēja radīt kolonijas, kas ir ievērojami lielākas nekā nabassaites asiņu vai kaulu smadzeņu HSC augšanas šūnas, un tas attiecas uz visiem koloniju veidiem. Jau šis fakts vien norāda uz embrionālo aknu hematopoētisko šūnu augstāku proliferācijas potenciālu. Embrionālo aknu hematopoētisko cilmes šūnu unikāla īpašība ir īsāks šūnu cikls salīdzinājumā ar citiem avotiem, kam ir liela nozīme no hematopoētisko orgānu repopulācijas efektivitātes viedokļa transplantācijas laikā. No nobrieduša organisma avotiem iegūtās hematopoētiskās suspensijas šūnu sastāva analīze liecina, ka visos ontoģenēzes posmos kodola šūnas pārsvarā pārstāv galīgi diferencētas šūnas, kuru skaits un fenotips ir atkarīgs no hematopoētisko audu donora ontogēniskā vecuma. Jo īpaši kaulu smadzeņu un nabassaites asiņu mononukleāro šūnu suspensijas sastāv no vairāk nekā 50% nobriedušu limfoīdo sēriju šūnu, savukārt embrionālo aknu hematopoētiskajos audos ir mazāk nekā 10% limfocītu. Turklāt mieloīdās cilmes šūnas embrionālajās un augļa aknās galvenokārt pārstāv eritroīdās sērijas, savukārt nabassaites asinīs un kaulu smadzenēs dominē granulocītu-makrofāgu elementi.

Svarīgi ir arī tas, ka embrionālās aknas satur pilnu agrāko hematopoētisko prekursoru komplektu. Starp pēdējām jāatzīmē eritroīdās, granulopoētiskās, megakariopoētiskās un daudzlīniju koloniju veidojošās šūnas. To primitīvākie prekursori - LTC-IC - spēj vairoties un diferencēties in vitro 5 nedēļas vai ilgāk, kā arī saglabā funkcionālo aktivitāti pēc iesakņošanās recipienta organismā allogēnas un pat ksenogēnas transplantācijas laikā dzīvniekiem ar imūndeficītu.

Eritroīdo šūnu pārsvara bioloģiskā lietderība embrionālajās aknās (līdz 90% no kopējā hematopoētisko elementu skaita) ir saistīta ar nepieciešamību nodrošināt strauji pieaugošo attīstošā augļa asins tilpumu ar eritrocītu masu. Embrionālajās aknās eritropoēzi pārstāv dažādas brieduma pakāpes kodola eritroīdo prekursori, kas satur augļa hemoglobīnu (a2u7), kas, pateicoties augstākajai afinitātei pret skābekli, nodrošina efektīvu pēdējā uzsūkšanos no mātes asinīm. Eritropoēzes intensifikācija embrionālajās aknās ir saistīta ar lokālu eritropoetīna (EPO) sintēzes palielināšanos. Jāatzīmē, ka eritropoetīna klātbūtne vien ir pietiekama, lai realizētu hematopoētisko šūnu hematopoētisko potenciālu embrionālajās aknās, savukārt kaulu smadzeņu un nabassaites asiņu HSC iesaistīšanai eritropoēzē ir nepieciešama citokīnu un augšanas faktoru kombinācija, kas sastāv no EPO, SCF, GM-CSF un IL-3. Tajā pašā laikā agrīnās hematopoētiskās cilmes šūnas, kas izolētas no embrionālajām aknām un kurām nav EPO receptoru, nereaģē uz eksogēnu eritropoetīnu. Eritropoēzes indukcijai embrionālo aknu mononukleāro šūnu suspensijā ir nepieciešamas progresējošākas eritropoetīnam jutīgas šūnas ar CD34+CD38+ fenotipu, kas ekspresē EPO receptoru.

Literatūrā joprojām nav vienprātības par hematopoēzes attīstību embrionālajā periodā. Nav noteikta hematopoētisko cilmes šūnu ekstraembrionālo un intraembrionālo avotu esamības funkcionālā nozīme. Tomēr nav šaubu, ka cilvēka embrioģenēzē aknas ir centrālais hematopoēzes orgāns un 6. līdz 12. grūtniecības nedēļā kalpo par galveno hematopoētisko cilmes šūnu avotu, kas apdzīvo liesu, aizkrūtes dziedzeri un kaulu smadzenes. GDR nodrošina atbilstošo funkciju veikšanu prenatālajā un postnatālajā attīstības periodā.

Vēlreiz jāatzīmē, ka embrionālās aknas, salīdzinot ar citiem avotiem, raksturo visaugstākais HSC saturs. Aptuveni 30% embrionālo aknu CD344 šūnu ir CD38 fenotips. Tajā pašā laikā limfoīdo cilmes šūnu (CD45+) skaits hematopoēzes sākumposmā aknās nepārsniedz 4%. Ir konstatēts, ka, auglim attīstoties, no 7. līdz 17. grūtniecības nedēļai, B limfocītu skaits progresīvi palielinās ar ikmēneša "soli" 1,1%, savukārt HSC līmenis pastāvīgi samazinās.

Hematopoētisko cilmes šūnu funkcionālā aktivitāte ir atkarīga arī no to avota embrionālās attīstības perioda. Cilvēka embriju aknu šūnu koloniju veidojošās aktivitātes pētījums 6.-8. un 9.-12. grūtniecības nedēļā kultivēšanas laikā pusšķidrā vidē SCF, GM-CSF, IL-3, IL-6 un EPO klātbūtnē parādīja, ka kopējais koloniju skaits ir 1,5 reizes lielāks, iesējot embrionālo aknu HSC agrīnās attīstības stadijās. Tajā pašā laikā mielopoēzes cilmes šūnu, piemēram, CFU-GEMM, skaits aknās 6.-8. embriogenēzes nedēļās ir vairāk nekā trīs reizes lielāks nekā to skaits 9.-12. grūtniecības nedēļās. Kopumā embriju hematopoētisko aknu šūnu koloniju veidojošā aktivitāte grūtniecības pirmajā trimestrī bija ievērojami augstāka nekā augļa aknu šūnu koloniju veidojošā aktivitāte grūtniecības otrajā trimestrī.

Iepriekš minētie dati liecina, ka embrionālās aknas embriogenēzes sākumā izceļas ne tikai ar palielinātu agrīno hematopoētisko cilmes šūnu saturu, bet arī to hematopoētiskajām šūnām raksturīgs plašāks diferenciācijas spektrs dažādās šūnu līnijās. Šīm embrionālo aknu hematopoētisko cilmes šūnu funkcionālās aktivitātes iezīmēm var būt zināma klīniska nozīme, jo to kvalitatīvās īpašības ļauj sagaidīt izteiktu terapeitisko efektu, transplantējot pat nelielu skaitu šūnu, kas iegūtas agrīnās grūtniecības stadijās.

Tomēr efektīvai transplantācijai nepieciešamā hematopoētisko cilmes šūnu daudzuma problēma joprojām ir atklāta un aktuāla. Tiek mēģināts to risināt, izmantojot embrionālo aknu hematopoētisko šūnu augsto pašreprodukcijas potenciālu in vitro, stimulējot tās ar citokīniem un augšanas faktoriem. Ar pastāvīgu agrīno embrionālo aknu HSC perfūziju bioreaktorā pēc 2-3 dienām ir iespējams iegūt hematopoētisko cilmes šūnu daudzumu pie izejas, kas ir 15 reizes lielāks par to sākotnējo līmeni. Salīdzinājumam jāatzīmē, ka, lai tādos pašos apstākļos panāktu 20 reižu lielāku cilvēka nabassaites asiņu HSC iznākumu, nepieciešamas vismaz divas nedēļas.

Tādējādi embrionālās aknas atšķiras no citiem hematopoētisko cilmes šūnu avotiem ar lielāku gan iesaistīto, gan agrīno hematopoētisko cilmes šūnu saturu. Kultūrā ar augšanas faktoriem embrionālās aknu šūnas ar CD34+CD45Ra1 CD71l0W fenotipu veido 30 reizes vairāk koloniju nekā līdzīgas nabassaites asins šūnas un 90 reizes vairāk nekā kaulu smadzeņu HSC. Visizteiktākās atšķirības norādītajos avotos ir agrīno hematopoētisko cilmes šūnu saturā, kas veido jauktas kolonijas - CFU-GEMM daudzums embrionālajās aknās pārsniedz nabassaites asinīs un kaulu smadzenēs attiecīgi 60 un 250 reizes.

Svarīgi ir arī tas, ka līdz 18. embrionālās attīstības nedēļai (hematopoēzes sākuma periods kaulu smadzenēs) vairāk nekā 60% aknu šūnu ir iesaistītas hematopoētiskās funkcijas īstenošanā. Tā kā cilvēka auglim līdz 13. attīstības nedēļai nav aizkrūtes dziedzera un attiecīgi arī timocītu, hematopoētisko šūnu transplantācija no 6.–12. grūtniecības nedēļas embrionālajām aknām ievērojami samazina “transplantāta pret saimnieku” reakcijas attīstības risku un neprasa histosaderīga donora izvēli, jo tas atvieglo hematopoētiskā himērisma sasniegšanu.